一种检测环境中铅离子的方法技术

本发明专利技术公开了一种检测铅离子的方法，该方法将序列表中序列1、2分别用缓冲溶液稀释后，混合杂交后形成核酸酶溶液，序列1和序列2的摩尔比为1:1～3:1；将预处理后的待测样品加入到核酸酶溶液中，静置使核酸酶与铅离子完全反应，之后加入序列3，序列3与2摩尔比1:1～3:1；再静置，然后再加入氯化血晶素，得到A溶液；B溶液是含有鲁米诺，双氧水和对碘苯酚的缓冲水溶液；再将A溶液和B溶液按照体积比为1:2～2:1的比例缓慢混合，混合反应的同时检测混合溶液的化学发光强度；根据混合溶液的化学发光强度得到待测样品的铅离子浓度。本发明专利技术用于检测铅离子含量，具有灵敏度高，选择性好，且具有很好的重复性，操作简单易行，可直接应用于环境中铅离子的检测。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种检测铅离子的方法，该方法将序列表中序列1、2分别用缓冲溶液稀释后，混合杂交后形成核酸酶溶液，序列1和序列2的摩尔比为1:1～3:1；将预处理后的待测样品加入到核酸酶溶液中，静置使核酸酶与铅离子完全反应，之后加入序列3，序列3与2摩尔比1:1～3:1；再静置，然后再加入氯化血晶素，得到A溶液；B溶液是含有鲁米诺，双氧水和对碘苯酚的缓冲水溶液；再将A溶液和B溶液按照体积比为1:2～2:1的比例缓慢混合，混合反应的同时检测混合溶液的化学发光强度；根据混合溶液的化学发光强度得到待测样品的铅离子浓度。本专利技术用于检测铅离子含量，具有灵敏度高，选择性好，且具有很好的重复性，操作简单易行，可直接应用于环境中铅离子的检测。【专利说明】
本专利技术属于金属离子检测领域，具体涉及一种铅离子的检测方法，尤其适用于检测环境中的铅离子的浓度。
技术介绍
目前，检测铅离子的方法有多种，常用的有微分电位溶出分析法、石墨炉原子吸收光谱法、氢化物发生原子荧光光谱法、电感耦合等离子体质谱法、双硫腙比色法等。微分电位溶出分析法方法简便，灵敏度较高，但容易受到有机物的干扰；石墨炉原子吸收光谱法准确度和精密度好，基底干扰效应小，但检测较为耗时；氢化物发生原子荧光光谱法特异性较好，但荧光转换效率较低，散射光影响较大，且需专业人员操作；电感耦合等离子体质谱法灵敏度高，检测范围宽，是公认的最好方法，但其存在基体干扰问题，且仪器和检测成本高昂；双硫腙比色法结果准确可靠，稳定性好，但操作繁琐，灵敏度相对较低。因此研究高灵敏度高特异性的铅检测方法十分必要。‘8-17’核酸酶在1997年首先由Santoro and Joyce报道,它具有一个铅离子高特异性的切位点，这引起了研究人员的极大兴趣将之用于铅离子的检测。目前，已有人利用‘8-17’DNA酶基于色度法、荧光法以及电化学方法完成了对铅离子的检测。然而，色度法分离样品时前处理步骤繁琐且难以达到微量检测水平；荧光法尽管灵敏度较高但准确性差；而低特异性及低灵敏度也一直是电化学方法检测的难题。化学发光法无需要外来光源的激发，具有背景干扰小、灵敏度高、易于检测、免标记荧光基团或电活性分子等优点，因此在生化分析中得到广泛应用。特别是借助于过氧化氢酶催化鲁米诺的化学发光，已在金属离子的检测领域得到有效应用。上世纪90年代，Sen等首次报道了一种具有类似过氧化氢酶催化活性的氯化血红素/G-四链体结构，此后，随后众多研究者都利用这种具有催化鲁米诺发光的无酶体系来检测金属离子，包括结合‘8-17’核酸酶用于铅离子的检测。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种操作简单易行、灵敏度高和选择性好的检测铅离子的方法。本专利技术提供的一种检测铅离子的方法，包括下述步骤:第I步配制A溶液和B溶液:将序列表中序列I和序列2分别用缓冲溶液稀释后，再混合杂交后形成核酸酶溶液，序列I和序列2的摩尔比为1:1?3:1 ;将预处理后的待测样品加入到核酸酶溶液中，核酸酶溶液中核酸酶的浓度为0.1 μ mol/L?I μ mol/L ;静置使核酸酶与铅离子完全反应，之后加入序列3，序列3与序列2摩尔比1:1?3:1 ;再静置，然后再加入氯化血晶素，得到A溶液，最终A溶液中，氯化血晶素的浓度为0.02 μ mol/L?0.2 μ mol/L ；所述B溶液是含有鲁米诺，双氧水和对碘苯酚的缓冲水溶液，B溶液中，鲁米诺的浓度为0.0lmmol/L?0.15mmol/L,双氧水的浓度为0.0SmmoI /I,?0.75mmol/L,对鹏苯酌.的浓度为 0.0SmmoI /I,?0.7SmmoI /I,；第2步将A溶液和B溶液按照体积比为1:2?2:1的比例缓慢混合，混合反应的同时检测混合溶液的化学发光强度；第3步根据混合溶液的化学发光强度得到待测样品的铅离子浓度。作为上述技术方案的改进，所述缓冲溶液为浓度10?lOOmmol/L的HEPES溶液，浓度为 10 ?200mmol/L 的 Tris-HCl,浓度为 10 ?200mmol/L 的 Tris-Acetate,或者浓度为10?lOOmmol/L的PBS溶液，缓冲液的pH值范围在7.0?10 ;稀释后序列I和序列2的摩尔浓度均为0.1 μ mol/L?I μ mol/L。作为上述技术方案的进一步改进，所述待测样品的预处理过程为:向待测样品中加入过量的浓硝酸溶液，搅拌加热至90° C以上但是不沸腾，保温让待测样品全部被浓硝酸氧化溶解，得到硝酸酸化的溶液；然后，让所述溶液冷却至60° C以下，再将过量的双氧水缓慢加入其中，搅拌加热至90° C以上但是出现沸腾，直至没有气泡产生；再将所得溶液冷却至60° C以下，加入过量的盐酸溶液，搅拌加热不出现沸腾，保温IOmin?Ih ;冷却至室温后，将所得溶液过滤，蒸发浓缩，然后用缓冲溶液定容，得到预处理之后的待测样品。作为上述技术方案的更进一步改进，所述待测样品的预处理过程为:第3步是将得到的化学发光强度与标准曲线比较，所对应的铅离子浓度作为待测样品的铅离子浓度。所述标准曲线的制作过程为:(al)配制铅离子溶液的浓度梯度，包括N个浓度，N≥11 ；(a2)按照第2步相同的方式配制N份A溶液和N份B溶液:(a3)将N份A溶液分别和N份B溶液分别按照体积比为1:2?2:1的比例缓慢混合，混合反应的同时检测混合溶液的化学发光强度；(a4)以化学发光强度及铅离子浓度分别作为纵横坐标，利用N个化学发光强度及其所对应的铅离子浓度绘制曲线，得到标准曲线。本专利技术实现了，利用铅离子能特异性切割核酸酶之后，能够形成具有类似过氧化氢酶活性的四链体结构，催化鲁米诺氧化产生化学发光。该方法操作简单易行，具有灵敏度高、选择性好等优点，所设计的核酸酶传感器检测限可达0.79nmol/L，具有很好的重现性，可直接应用于环境中铅离子的检测。【专利附图】【附图说明】图1为所设计的‘8-17’核酸酶的序列。图2为铅离子化学发光检测原理图。图3为实例I中化学发光强度与铅离子浓度的关系图，其中，A为关系图，B为标准曲线。图4为天然湖水中铅离子浓度的检测结果。图5为基于核酸酶的铅离子检测的特异性图6为基于核酸酶的铅离子检测重现性。图7为序列表中三个序列。【具体实施方式】下面结合附图对本专利技术的【具体实施方式】作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本专利技术，但并不构成对本专利技术的限定。此外，下面所描述的本专利技术各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。‘8-17，核酸酶在 1997 年首先由 Santoro 和 Joyce (Santoro S.ff., Joyce G.F.; 一种通用的RNA切点核酸酶；Proc.Natl.Acad.Sc1.USA)报道，陆艺等人(李静，陆艺；一种高灵敏度高选择性检测铅离子的核酸酶生物传感器J.AM.Chem.Soc.)证实了其具有一个铅离子高特异性的切位点。在此研究中，本专利技术选取了此核酸酶的酶链序列和基链序列。具体合成设计了以下三段序列:第一段序列为核酸酶的酶链序列，含有33个碱基(如SEQ ID N0.1所示，即CCACTC TTC TCC GAG CCG GTC GAA ATA GT本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测铅离子的方法，包括下述步骤：第1步配制A溶液和B溶液：将序列表中序列1和序列2分别用缓冲溶液稀释后，再混合杂交后形成核酸酶溶液，序列1和序列2的摩尔比为1:1～3:1；将预处理后的待测样品加入到核酸酶溶液中，核酸酶溶液中核酸酶的浓度为0.1μmol/L～1μmol/L；静置使核酸酶与铅离子完全反应，之后加入序列3，序列3与序列2摩尔比1:1～3:1；再静置，然后再加入氯化血晶素，得到A溶液，最终A溶液中，氯化血晶素的浓度为0.02μmol/L～0.2μmol/L；所述B溶液是含有鲁米诺，双氧水和对碘苯酚的缓冲水溶液，B溶液中，鲁米诺的浓度为0.01mmol/L～0.15mmol/L，双氧水的浓度为0.05mmol/L～0.75mmol/L，对碘苯酚的浓度为0.05mmol/L～0.75mmol/L；第2步将A溶液和B溶液按照体积比为1:2～2:1的比例缓慢混合，混合反应的同时检测混合溶液的化学发光强度；第3步根据混合溶液的化学发光强度得到待测样品的铅离子浓度。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：赵元弟，周子明，
申请(专利权)人：华中科技大学，
类型：发明
国别省市：