本发明专利技术公开了一种基于Au?NPs和DNA循环双放大技术的适配体传感器构建及其在腺苷检测中的应用，属于适配体传感技术领域。该检测系统包含腺苷适配体、与适配体部分杂交的探针DNA、Au?NPs标记的发夹结构DNA和组装在金片表面的发夹结构DNA。当没有腺苷时，Au?NPs标记DNA保持发夹结构而不能与金片表面的发夹DNA杂交，无法将Au?NPs捕获到金片表面。当存在腺苷时，腺苷与其适配体结合，探针DNA则从适配体/探针DNA双链中释放出来而与Au?NPs标记的发夹DNA杂交使其开环，开环后的AuNPs标记DNA与金片表面的DNA杂交将Au?NPs捕获到金片上，替换出来的探针DNA引发下一轮DNA链替换反应，如此循环，单个腺苷分子可引发大量Au?NPs组装到金片上，获得增强的SPR信号，用于对腺苷的高灵敏检测。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种基于Au?NPs和DNA循环双放大技术的适配体传感器构建及其在腺苷检测中的应用，属于适配体传感
。该检测系统包含腺苷适配体、与适配体部分杂交的探针DNA、Au?NPs标记的发夹结构DNA和组装在金片表面的发夹结构DNA。当没有腺苷时，Au?NPs标记DNA保持发夹结构而不能与金片表面的发夹DNA杂交，无法将Au?NPs捕获到金片表面。当存在腺苷时，腺苷与其适配体结合，探针DNA则从适配体/探针DNA双链中释放出来而与Au?NPs标记的发夹DNA杂交使其开环，开环后的AuNPs标记DNA与金片表面的DNA杂交将Au?NPs捕获到金片上，替换出来的探针DNA引发下一轮DNA链替换反应，如此循环，单个腺苷分子可引发大量Au?NPs组装到金片上，获得增强的SPR信号，用于对腺苷的高灵敏检测。【专利说明】基于Au NPs和DNA循环双放大技术的适配体传感器构建及应用
本专利技术涉及一种基于Au NPs和DNA循环双放大技术的适配体传感器构建及其在腺苷检测中的应用，属于适配体传感
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技术介绍
适配体是指经指数富集的配体系统进化技术体外筛选合成得到的一小段单链寡核昔酸序列，对目标分子具有高度亲和性和特异性的识别能力。与抗体为识别元件相比，适配体具有配体广泛、易合成、易标记、化学稳定性好等优势，被广泛应用于目标分子的识别与检测。迄今为止，已有各种以核酸适配体为识别元素的比色传感器、荧光传感器、电化学传感器、发光传感器、石英晶体微天平传感器、表面等离子体共振(SPR)传感器的报道。其中，基于SPR检测法的适配体传感器因无需标记、高灵敏及实时监测等优势而具有良好的应用前景。大部分SPR适配体传感器采用夹心检验法、目标引发构像改变或目标引发链替换与竞争相结合等原理实现对生物分子的检测。尽管这些传感器对目标分子的检测具有较高的选择性和灵敏度，但它们大多按1:1的信号:目标物比例输出信号，无法实现低浓度物质特别是小分子和核酸等的高灵敏检测。因此，发展高灵敏的SPR传感技术用于检测低浓度生物分子具有重要意义。近年来，核酸分子扩增技术被广泛用于提高适配体传感器的检测灵敏度，如，靶诱导替换聚合、滚环放大、聚合酶链反应、基于核酸内切酶的信号放大反应等。这些方法虽然提高了检测灵敏度，但它们往往需要用到蛋白酶，不仅增加了分析成本，还需要精确控制蛋白酶的反应条件，大大限制了应用。发展无酶放大方法用于生物分子的高灵敏检测尤为重要。基于杂交和链替换的无酶放大技术(如杂交链扩增反应、熵驱动催化、目标催化发夹组装)，由于模式固有、易于扩展、无需使用蛋白酶等特点，具有广阔的应用前景。然而，迄今尚未见基于无酶放大技术的SPR适配体传感器用于小分子高灵敏检测的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种基于Au NPs和DNA循环双放大技术的适配体传感器构建及其在腺苷检测中的应用，它具有检测灵敏和选择性好的优点。本专利技术是这样来实现的，在包含腺苷适配体、与适配体部分杂交的探针DNA(c-DNAl)、Au NPs标记的发夹结构DNA (Au-H-DNAl)、预组装在SPR金片上的巯基化发夹结构DNA (H-DNA2)的实验体系中，当没有目标分子腺苷存在时，Au-H-DNAl上的H-DNAl保持发夹结构而不能与预组装在金片表面的发夹结构H-DNA2杂交，无法将Au NPs捕获到金片表面。然而，当存在目标分子腺苷时，腺苷与适配体特异性结合促使适配体发生折叠而构象改变，使得c-DNAl从适配体/c-DNAl双链中释放出来与Au-H-DNAl杂交使其开环，开环后的Au-H-DNAl与预组装在金片表面的H-DNA2杂交将Au NPs捕获到金片上，同时替换出c-DNAl，替换出来的c-DNAl则引发下一轮DNA链替换循环。通过如此DNA链替换循环，单个腺苷分子则可引发大量Au-H-DNAl组装在SPR金片上。Au NPs对SPR信号的放大效应，使得SPR测量信号大大增强，对腺苷的检测限低至PM级别。同时，适配体的高特异性，使得传感器具有良好的抗干扰能力。本专利技术基于Au NPs对SPR信号耦合放大效应和目标物引发DNA链替换循环双重放大策略构建的SPR适配体传感器，为低浓度生物小分子的高灵敏和选择性检测提供了普适性平台，具有良好的应用前景。为成功构建所述的适配体传感器，本专利技术采用以下技术方案: 基于Au NPs和DNA循环双放大技术的适配体传感器构建包括以下步骤: (1)AuNPs的制备:将50 mL的质量百分比为0.01%的HAuCl4溶液加入到100 mL圆底烧瓶中，加热至沸腾后，在机械搅拌下迅速加入I mL的质量百分浓度为5%的柠檬酸三钠溶液，继续搅拌并保持沸腾，溶液颜色由黄色变成深酒红色时停止加热，搅拌下自然冷却至室温，即获得平均粒径为13 nm的稳定且单分散的Au NPs，于4 ° C保存备用； (2)Au NPs-H-DNAl的制备:巯基化H-DNAl用100 μ L新配制的I mM 二硫苏糖醇溶液活化过柱后，与I mL步骤(I)制备的Au NPs溶液混合，在摇床上振荡孵育12 h，将产物分散于磷酸盐(PBS)缓冲溶液中，25 ° C放置40 h;在14000 rpm下离心10 min，弃去上清液，离心后的红色油状沉淀用PBS缓冲溶液清洗并离心3次，除去没有与Au NPs反应的H-DNAl ;将获得的Au NPs-H-DNAl重悬于PBS缓冲溶液中，4 ° C下保存备用； (3)SPR适配体传感界面的构建:将金片在体积比7:3的H2SO4 = H2O2混合溶液中浸泡2min，用二次水冲洗干净，浸入10 mM的巯基己醇溶液中2 h，用二次水冲洗并用氮气吹干后，装入SPR检测池；注入50 μ LU.2 μΜ的巯基化发夹结构H-DNA2溶液反应2 h，制得预组装了 H-DNA2的传感界面； 上述步骤中，步骤(2)中，所述的二硫苏糖醇溶液用浓度为170 mM、pH为8.0的磷酸盐缓冲溶液配制。所述的磷酸盐缓冲溶液浓度为10 mM，pH为7.4，含0.1 M NaCl。步骤(3)中，所述的巯基己醇溶液用无水乙醇配制。所述的巯基化发夹结构DNA溶液用浓度为10mM、pH为7.4且含0.1 M NaCl的磷酸盐缓冲溶液配制。基于Au NPs和DNA循环双放大技术的适配体传感器的应用，是指它在腺苷检测中的应用:20 μ LU.0 μ M的腺苷适配体和相同比例的探针DNA在37 ° C孵育2 h，形成适配体/c-DNAl双链；加入20 μ L不同浓度的腺苷溶液，在37 ° C孵育2 h，腺苷与其适配体特异性结合而将探针DNA从适配体/c-DNAl双链中释放出来；取25 μ L上述溶液加入到25 μ L Au NPs-H-DNAl溶液中，将该混合溶液注入到SPR检测池中使其与预组装于传感界面的H-DNA2反应I h ;用蠕动泵将反应溶液排出并注入50 μ L 二次水进行清洗；随着腺苷浓度的增大，捕获到传感界面的Au NPs逐渐增多，SPR响应信号迅速增强，SPR角度变化与腺苷浓度在0.5-50 ρΜ范围内呈良好的线性关系，检测限为0.21 PM，可用于对腺苷的超灵敏和超低浓度检测。本专利技术的技术效果本文档来自技高网...
【技术保护点】
基于Au?NPs和DNA循环双放大技术的适配体传感器构建，其特征在于所述构建包括以下步骤：（1）Au?NPs的制备：将50?mL的质量百分比为0.01%的HAuCl4溶液加入到100?mL圆底烧瓶中，加热至沸腾后，在机械搅拌下迅速加入1?mL的质量百分浓度为5%的柠檬酸三钠溶液，继续搅拌并保持沸腾，溶液颜色由黄色变成深酒红色时停止加热，搅拌下自然冷却至室温，即获得平均粒径为13?nm的稳定且单分散的Au?NPs，于4?°C保存备用；（2）Au?NPs标记发夹结构DNA的制备：巯基化DNA用100?μL新配制的1?mM二硫苏糖醇溶液活化过柱后，与1?mL步骤（1）制备的Au?NPs溶液混合，在摇床上振荡孵育12?h，将产物分散于磷酸盐缓冲溶液中，25?°C放置40?h；在14000?rpm下离心10?min，弃去上清液，离心后的红色油状沉淀用磷酸盐缓冲溶液清洗并离心3次，除去没有与Au?NPs反应的DNA；将获得的Au?NPs标记的发夹结构DNA重悬于磷酸盐缓冲溶液中，4?°C下保存备用；（3）SPR适配体传感界面的构建：将金片在体积比7:3的H2SO4:H2O2混合溶液中浸泡2?min，用二次水冲洗干净，浸入10?mM的巯基己醇溶液中2?h，用二次水冲洗并用氮气吹干后，装入SPR检测池；注入50?μL、1.2?μM的巯基化发夹结构DNA溶液反应2?h，制得预组装了巯基化发夹结构DNA的传感界面。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：邱建丁，姚桂红，梁汝萍，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：
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