虾蟹类酚氧化酶活性的准确测定方法，脏抽取血淋巴液待测，鳃组织酚氧化酶制备，在冰袋上迅速采集鳃组织样品，加无菌生理盐水，冰浴匀浆，匀浆液经离心，吸取上清液保存待测，加入磷酸钾缓冲液，于水浴中预处理使缓冲液温度达到预设温度，加入L-DOPA和待测样品，充分混匀，迅速测定波长490nm时的初始吸光度值，同时开始水浴计时，水浴，测定吸光度（OD）值，每组另取两只试管分别测底物L-DOPA和样品在490nm的吸光度为ODL和OD0作为对照，每组平行3次，以平均每分钟（t）OD490nm增加0.001作为一个酶活力单位(U)，计算公式:PO=(OD-ODL-OD0)/t。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】虾蟹类酚氧化酶活性的准确测定方法，脏抽取血淋巴液待测，鳃组织酚氧化酶制备，在冰袋上迅速采集鳃组织样品，加无菌生理盐水，冰浴匀浆，匀浆液经离心，吸取上清液保存待测，加入磷酸钾缓冲液，于水浴中预处理使缓冲液温度达到预设温度，加入L-DOPA和待测样品，充分混匀，迅速测定波长490nm时的初始吸光度值，同时开始水浴计时，水浴，测定吸光度（OD）值，每组另取两只试管分别测底物L-DOPA和样品在490nm的吸光度为ODL和OD0作为对照，每组平行3次，以平均每分钟（t）OD490nm增加0.001作为一个酶活力单位(U)，计算公式:PO=(OD-ODL-OD0)/t。【专利说明】
本专利技术涉及酚氧化酶活性的测定方法，尤其是克氏原螯虾酚氧化酶活性的准确测定方法。
技术介绍
我国水产甲壳动物资源十富，种类繁多。甲壳类的虾、蟹以其味美及营养价值高而深受人们喜爱。虾、蟹既是我国渔业经济十的重要产业，又是出口创汇的主要产品之一。克氏原螯奸(Procambarus clarkii)俗称小龙奸，原产于墨西哥北部和美国南部，20世纪初传入我国。克氏原螯虾是世界性的食用虾，我国售价不断攀升，是出口创汇是重要虾品之一，是目前在国内外市场上极为热销的淡水大型奸类之一，养殖规模正逐年扩大，养殖密度逐渐提闻。甲壳类等节肢动物不具有特异性免疫功能，免疫防御是通过非特异性免疫发挥作用。酹氧化酶原激活系统(prophenoloxidase activating system)是甲壳动物重要的防御和识别系统，由丝氨酸蛋白酶和其他相关因子组成，类似于脊椎动物补体系统，在识别异物、释放调理素促进血细胞的吞噬和包囊以及产生杀灭和排除异物的凝集素和溶菌酶等免疫功能方面发挥重要作用。酚氧化酶(phenoloxidase，PO)是酚氧化酶原激活系统的产物，是衡量机体免疫功能的重要指标，也是一些疾病的诊断的判断依据。许多学者在测定酚氧化酶活力时采用冰浴终止反应的方法来检测，也有部分人采用测定一段时间内酚氧化酶反应底物生成物浓度来判断其活性的，但许多在测定时间和测定温度方面均不统一，因而在测定结果准确性、效率性方面不尽如人意。
技术实现思路
专利技术目的:针对以上技术现状，本专利技术所要解决的技术问题是提供一种准确、高效的测定克氏原螯虾酚氧化酶活性性状的方法。本专利技术技术方案为:，其特征在于包括以下步骤:I)血清酚氧化酶的制备:用5ml —次性注射器刺破头胸甲从心脏抽取血淋巴液于2ml离心管中4°C放置过夜，待血清析出后10000r/min4°C离心lOmin，上清液于洁净离心管中保存待测；2)组织酚氧化酶的制备:在冰袋上迅速采集鳃组织样品，加9倍质量4°C无菌生理盐水使其浓度达到0.lg/ml，冰浴匀浆，匀浆液经3000r/min4°C离心lOmin，吸取上清液于洁净的离心管中保存备用；3)取洁净的IOml刻度试管，加入pH为5.5 (鳃)或6.5 (血清)的0.lmol/L磷酸钾缓冲液3ml，于35°C水浴中预处理5min使缓冲液温度达到预设温度。水浴温度为35°C。4)加入0.1mL0.01mol/L的L-D0PA和0.1mL待测样品，充分混匀，迅速测定波长490nm时的初始吸光度值，同时开始水浴计时，水浴6min，测定第6min时的吸光度(OD)值；5)每组另取两只试管分别测底物L-DOPA和样品在490nm的吸光度为0?和ODtl作为对照。每组平行3次。以均等时间0D490nm增加相应的数值作为一个酶活力单位(U)，计算公式=PO=(OD-ODfC)DciVttj均等时间可设为lmin，相应的数值为0.001。本专利技术的有益效果:1、能准确测定克氏原螯虾酚氧化酶活性，可以预测克氏原螯虾的健康状况，同时可作为一些疑难疾病的诊断标准。2、本检测方法具有准确、快键、经济的特点，适用于科研单位、技术推广站及企业快速诊断虾病。【具体实施方式】以下结合实施例子对本专利技术进一步作详细描述。实施例1①称取Ig的原料虾鳃组织，加9ml生理盐水，用组织匀浆器或匀浆仪冰浴匀浆。②匀浆液经3000r/min4°C离心lOmin，吸取上清液于洁净的离心管中保存待测。③酶活测定:取洁净的IOml刻度试管，加入pH为5.5的0.lmol/L磷酸钾缓冲液3ml，于35°C水浴中预处理5min使缓冲液温度达到预设温度。④加入0.1mL0.01mol/L的L-D0PA和0.1mL待测样品，充分混匀，迅速测定波长490nm时的初始吸光度值，同时开始水浴计时，水浴6min，测定第6min时的吸光度(OD)值； ⑤每组另取两只试.管分别测底物L-DOPA和样品在490nm的吸光度为0?和ODtl作为对照。每组平行3次。以平均每分钟(t)0D490nm增加0.001作为一个酶活力单位(U)，计算公式:PO= (OD-ODl-ODq)/t。实施例2:①血清酚氧化酶的制备:用5ml 一次性注射器刺破头胸甲从心脏抽取血淋巴液于2ml离心管中4°C放置过夜。②待血清析出后10000r/min4°C离心lOmin，上清液于洁净离心管中保存待测；③酶活测定:取洁净的IOml刻度试管，加入pH为5.5的0.lmol/L磷酸钾缓冲液3ml，于35°C水浴中预处理5min使缓冲液温度达到预设温度。④加入0.1mL0.01mol/L的L-D0PA和0.1mL待测样品，充分混匀，迅速测定波长490nm时的初始吸光度值，同时开始水浴计时，水浴6min，测定第6min时的吸光度(OD)值；⑤每组另取两只试管分别测底物L-DOPA和样品在490nm的吸光度为0?和ODtl作为对照。每组平行3次。以平均每分钟(t)0D490nm增加0.001作为一个酶活力单位(U)，计算公式:PO= (OD-ODl-ODq)/t。实施例3:①血清酚氧化酶的制备:用5ml 一次性注射器刺破头胸甲从心脏抽取血淋巴液于2ml离心管中4°C放置过夜。②待血清析出后10000r/min4°C离心lOmin，上清液于洁净离心管中_20°C保存待测；③测定前将待测样品从冰箱取出，放入35°C水浴锅，待样品融化即可测定。④酶活测定:取洁净的IOml刻度试管，加入pH为5.5的0.lmol/L磷酸钾缓冲液3ml，于35°C水浴中预处理5min使缓冲液温度达到预设温度。⑤加入0.1mL0.01mol/L的L-D0PA和0.1mL待测样品，充分混匀，迅速测定波长490nm时的初始吸光度值，同时开始水浴计时，水浴6min，测定第6min时的吸光度(OD)值；⑥每组另取两只试管分别测底物L-DOPA和样品在490nm的吸光度为0?和ODtl作为对照。每组平行3次。以平均每分钟(t)0D490nm增加0.001作为一个酶活力单位(U)，计算公式:PO= (OD-ODl-ODq)/t。 以上显示和描述了本专利技术的基本原理和主要特征和本专利技术的优点。本行业的技术人员应了解，本专利技术不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本专利技术的原理，在不脱离本专利技术精神和范围的前提下，本专利技术还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本专利技术范围内，本专利技术要求保护范围由所附的权利要求书其等效物界定。【权利要求】1.一种克氏原螯虾酚氧化酶活性的检测方法，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种克氏原螯虾酚氧化酶活性的检测方法，其特征在于：A、血清酚氧化酶的制备：从虾蟹类动物心脏抽取血淋巴液于2ml离心管中4℃放置过夜，待血清析出后10,000r/min4℃离心10min，上清液于洁净离心管中保存待测；B、组织酚氧化酶的制备：在冰袋上迅速采集鳃组织样品，加9倍质量4℃无菌生理盐水使其浓度达到0.1g/ml，冰浴匀浆，匀浆液经3,000r/min4℃离心10min，吸取上清液于洁净的离心管中保存待测；C、取洁净的10ml刻度试管，加入缓冲液3ml，水浴中预处理5min使缓冲液温度达到预设温度。D、加入0.1ml0.01mol/l的L?DOPA和0.1ml待测样品，充分混匀，迅速测定波长490nm时的初始吸光度值，同时开始水浴计时，水浴一段时间后，测定其的吸光度即OD值；E每组另取试管分别测底物L?DOPA和样品在490nm的吸光度为ODL和OD0作为对照。每组平行3次；以均等时间OD490nm增加相应的数值作为一个酶活力单位，计算公式:PO=(OD?ODL?OD0)/t。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王建国，吴娟，朱光来，王权，
申请(专利权)人：江苏畜牧兽医职业技术学院，
类型：发明
国别省市：
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