一种抗菌肽及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开的一种抗菌肽，其基因序列为抗菌肽Snakin中无信号肽的基因编码序列。还公开了制备抗菌肽的方法，包括如下步骤，(1)提取辣椒叶片组织的总RNA，并采用反转录酶获得第一链cDNA备用；(2)经过PCR技术克隆得到抗菌肽Snakin中无信号肽的基因编码序列，记为Sn基因序列；(3)形成重组质粒；(4)筛选出重组成功的质粒，记为pET-Sn；(5)将上步重组成功的质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，并采用IPTG进行诱导表达，同时分泌出蛋白质；(6)对(5)步分泌出蛋白的感受态细胞进行超声波破碎，离心后收集上清液中的抗菌肽。本发明专利技术的优点为，得到了不含信号肽的抗菌肽，该抗菌肽对南方根结线虫有灭杀作用。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开的一种抗菌肽，其基因序列为抗菌肽Snakin中无信号肽的基因编码序列。还公开了制备抗菌肽的方法，包括如下步骤，(1)提取辣椒叶片组织的总RNA，并采用反转录酶获得第一链cDNA备用；(2)经过PCR技术克隆得到抗菌肽Snakin中无信号肽的基因编码序列，记为Sn基因序列；(3)形成重组质粒；(4)筛选出重组成功的质粒，记为pET-Sn；(5)将上步重组成功的质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，并采用IPTG进行诱导表达，同时分泌出蛋白质；(6)对(5)步分泌出蛋白的感受态细胞进行超声波破碎，离心后收集上清液中的抗菌肽。本专利技术的优点为，得到了不含信号肽的抗菌肽，该抗菌肽对南方根结线虫有灭杀作用。【专利说明】一种抗菌肽及其制备方法与应用
本专利技术属于生物
，具体是一种抗线虫肽及其制备方法与应用。
技术介绍
植物寄生线虫是农业生产中的一项重要病害，是世界性的病害，破坏性强、寄主种类多，分布范围广泛，防治难度极大，严重阻碍农业的持续发展，每年给全球农业造成1，570亿美元的经济损失。目前，植物寄生线虫的防治通常化学杀线虫剂、栽培技术和培育抗性品种等措施。但由于化学杀线虫药剂的食品安全及环境问题，其使用受到严格的控制。根结线虫寄主范围可以达到3000多种，主要危害植物的根部，因此通过轮作方法防治根结线虫是非常有限的。生物防治具有广阔的生物资源潜力，且对环境及人具有一定的安全性，但是生物防治效果不稳定且，易受环境影响，不易商品化，目前只有极少数的菌种用于生防。采用抗线虫基因是防治植物寄生性线虫的高效措施，但是现在发现的抗线虫基因数量很少，资源有限，且面临着线虫毒性种群分化导致抗性极易丧失等问题。Snakin为新型的植物抗菌肽，并已经发现其对植物寄生性线虫具有高效的防治作用，且具有生物安全、分子量小、易于遗传改造等特点，在防治植物寄生性线虫方面显示出独特的优势。因此，发掘和克隆植物中的Snakin家族基因为新型转基因抗线虫新品种培育提供重要的基因来源和技术支撑，对保障我国农业的可持续发展具有重要战略意义。植物抗菌肽(Antimicrobial protein AMP)是一类分子量小、呈碱性、富含半胱氨酸的短肽，为重要的蛋白酶抑制剂，通常在很低的浓度下(<106m)就能表现出广谱抗菌活性，在植物的防御反应中起着重要的作用，现在已经有超过500抗菌肽被报导。Snakin是一种新型的植物抗菌肽，通常富含半胱氨酸，分量小于llKDa，具有二硫键维持的稳定球形分子结构，具有与赤霉素诱 导蛋白及某些蛇毒素具有相似结构。Snakin蛋白属于GASA超家族，具有赤霉素诱导蛋白 的Pfam，他们在茄科植物中具有较高表达量。遗传分析证实Snakin家族包含三个亚家族，现在已经报道的相关基因有多个基因，分别来自不同的植物如马铃薯(Solanum tuberosum)、拟南芥(Arabidopsis)、辣椒(Capsicum annuum),以及番爺(Solanum Iycopersicum)。Snakin蛋白为既可以是植物本身组成型表达的一个防御蛋白，也可以被生物及非生物因素诱导表达的蛋白。无论是离体还是活体条件下Snakin蛋白都具有抗菌活性，例如抗细菌(Clavibacter michiganensis)及真菌作用。同时，Snakin蛋白处理根结线虫及秀丽杆线虫，发现证实该蛋白可以是秀丽杆线虫活性降低，生长停止直至死亡。通过基因组扫描可以发现在植物中Snakin家族基因是广泛存在的，且受生物及非生物诱导表达的第二亚家族基因数量要远远高于第1、3亚家族。说明在植物中少数Snakin基因是组成型表达，二大多数为诱导表达，也说明Snakin家族基因在抗线虫作用中具有重要的挖掘潜力。同时，Snakin基因与其他抗病基因具有很好的融合性，Snakin与植物防御素、Bt蛋白及多基因融合提供了支持，为提高寄主的抗植物寄生性线虫效果及其持久利用奠定了基础。
技术实现思路
基于上述原因，本专利技术提供了一种抗菌肽及其制备方法与应用，在不改变已知的辣椒抗菌肽Snakin氨基酸序列的前提下，克隆得到无信号肽的基因序列，这样得到的抗菌肽只含有成熟的抗菌肽，分子量更小，经过验证该抗菌肽可以用于防治南方根结线虫。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为，本专利技术得到的一种新的抗菌肽，其基因序列为抗菌肽Snakin中无信号肽的基因编码序列,该基因序列为:a1:tcaaactg atcatgttgc cagcaatgct atttctgaag ctgcttattc ctacaagaaa atcgattgtg ggggaaagtgttcagcgagg tgccgattat cgtcaaggcc aagattgtgt aagagggcat gtggaacttgctgtgctaga tgcaactgtg ttcctcctgg cacttctggc aacactcaga cttgcccttgctatgccaat atgactactc acggcaacag acgcaaatgc cct taa。该基因含有 246 个核昔酸，编码多肽含有81个氨基酸，分子量为8.7KDa,无辣椒抗菌肽Snakin信号肽序列，为成熟的抗菌肽基因序列，经过试验验证，可以对南方根结线虫起到灭杀``的作用。本专利技术还公开了一种制备所述抗菌肽的方法，包括如下步骤，(I)采用trizol方法提取辣椒叶片组织的总RNA，并采用反转录酶获得第一链cDNA备用；(2)根据已知抗菌肽Snakin基因的序列，设计上游引物、下游引物，以第一链cDNA为模板，经过PCR技术克隆得到抗菌肽Snakin中无信号肽的基因编码序列，并进行测序得到全长的基因序列，记为Sn基因序列；所述上游引物序列为5' ATT CAA ACT GAT CAT GTTGC3/，下游引物序列为【权利要求】1.一种抗菌肽，其特征在于，该抗菌肽的基因序列为抗菌肽Snakin中无信号肽的基因编石马序列，该基因序列为: 2.一种制备权利要求1所述抗菌肽的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤，⑴采用trizol方法提取辣椒叶片组织的总RNA，并采用反转录酶获得第一链cDNA备用； (2)根据已知抗菌肽Snakin基因的序列，设计上游引物、下游引物，以第一链cDNA为模板，经过PCR技术克隆得到抗菌肽Snakin中无信号肽的基因编码序列，并进行测序得到全长的基因序列，记为Sn基因序列；所述上游引物序列为Y ATT CAA ACT GAT CAT GTTGC3/，下游引物序列为 5' TTA AGG GCA TTT GCG TCT3/ ； (3)将(2)步得到的Sn基因序列克隆到原核表达载体pET28a(+)形成重组质粒； (4)再将(3)步得到的全部重组质粒转化到DH5ci细菌感受态细胞中，从中筛选出重组成功的质粒，记为pET-Sn ； (5)将上步重组成功的质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，并采用IPTG进行诱导表达，使感受态细胞表达出抗菌肽，记为抗菌肽Sn，同时分泌出蛋白质； (6)对(5)步分泌出蛋白的感受态细胞进行超声波破碎，离心后收集上清液中的抗菌肽。3.根据本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗菌肽，其特征在于，该抗菌肽的基因序列为抗菌肽Snakin中无信号肽的基因编码序列，该基因序列为：attcaaactg?atcatgttgc?cagcaatgct??atttctgaag??ctgcttattc??ctacaagaaa??atcgattgtg?ggggaaagtg??ttcagcgagg??tgccgattat??cgtcaaggcc??aagattgtgt?aagagggcat??gtggaacttg??ctgtgctaga??tgcaactgtg??ttcctcctgg?cacttctggc??aacactcaga??cttgcccttg??ctatgccaat??atgactactc?acggcaacag??acgcaaatgc??ccttaa。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：茆振川，张文玥，凌键，陈国华，杨宇红，谢丙炎，
申请(专利权)人：中国农业科学院蔬菜花卉研究所，
类型：发明
国别省市：