本发明专利技术公开了一种辅助鉴定棉花曲叶病毒的引物组合物及其应用。本发明专利技术提供的引物组合物，由DNA片段-Ⅰ、DNA片段-Ⅱ、DNA片段-Ⅲ、DNA片段-Ⅳ、DNA片段-Ⅴ和所述DNA片段-Ⅴ组成，均为单链DNA片段；所述DNA片段-Ⅰ如序列表的序列1所示，所述DNA片段-Ⅱ如序列表的序列2所示，所述DNA片段-Ⅲ如序列表的序列3所示，所述DNA片段-Ⅳ如序列表的序列4所示，所述DNA片段-Ⅴ如序列表的序列5所示。本发明专利技术为动态监测棉花曲叶病毒在我国的情况、控制其在我国境内大规模爆发、避免我国棉花产业的经济损失提供有力的保障。同时也可在国内的植保植检站、科研院所、进出口棉花生产企业及农户中大范围推广应用。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种辅助鉴定棉花曲叶病毒的引物组合物及其应用。本专利技术提供的引物组合物，由DNA片段-Ⅰ、DNA片段-Ⅱ、DNA片段-Ⅲ、DNA片段-Ⅳ、DNA片段-Ⅴ和所述DNA片段-Ⅴ组成，均为单链DNA片段；所述DNA片段-Ⅰ如序列表的序列1所示，所述DNA片段-Ⅱ如序列表的序列2所示，所述DNA片段-Ⅲ如序列表的序列3所示，所述DNA片段-Ⅳ如序列表的序列4所示，所述DNA片段-Ⅴ如序列表的序列5所示。本专利技术为动态监测棉花曲叶病毒在我国的情况、控制其在我国境内大规模爆发、避免我国棉花产业的经济损失提供有力的保障。同时也可在国内的植保植检站、科研院所、进出口棉花生产企业及农户中大范围推广应用。【专利说明】辅助鉴定棉花曲叶病毒的弓I物组合物及其应用
本专利技术涉及一种辅助鉴定棉花曲叶病毒的引物组合物及其应用。
技术介绍
棉花曲叶病毒属于双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)，为单链环状DNA植物病毒，具有典型的双联体颗粒形态，其基因组由单一组分组成。棉花曲叶病毒无性繁殖可以诱导产生轻微的非典型症状。侵染性分析表明，CLCuV DNAβ与CLCuV共同接种棉花后可诱导产生叶片卷缩、叶脉膨大、增厚、暗化、曲叶及耳突等CLCuV的田间典型症状。棉花曲叶病毒主要危害棉花、扶桑、菜豆、番茄和烟草等，在棉区普遍发生，疫区田间病株率在80%以上(甚至100%)，棉花病株生长严重衰退，造成减产，甚至绝收，危害十分严重。棉花曲叶病毒可经粉虱(Bemisia tabaci)以持久性方式传播，也可以通过嫁接传播。 目前，棉花曲叶病毒的检测较常用的方法有两种。一种是血清学检测方法，常见的有DAS-ELISA，血清学检测方法除了在灵敏度上存在不足外，其检测的特异性也受到限制(同属成员间的检测往往有交叉反应)。另一种是分子生物学检测方法，其中以RT-PCR最为常见，但是PCR需要特殊的仪器(PCR仪)。同时以上两种方法均需要较长的时间，血清学方法大约需要2天，分子生物学方法大约需要5小时，无法满足口岸快速检疫的要求。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种辅助鉴定棉花曲叶病毒的引物组合物及其应用。本专利技术首先保护引物组合物甲，由DNA片段-1、DNA片段-1I ,DNA片段-1I1、DNA片段-1V和DNA片段-V组成；所述DNA片段-1、所述DNA片段-11、所述DNA片段-1I1、所述DNA片段-1V和所述DNA片段-V均为单链DNA片段；所述DNA片段-1如序列表的序列I所示，所述DNA片段-1I如序列表的序列2所示，所述DNA片段-1II如序列表的序列3所示，所述DNA片段-1V如序列表的序列4所示，所述DNA片段-V如序列表的序列5所/Jn ο本专利技术还保护引物组合物乙，由DNA片段-V1、DNA片段-VI1、DNA片段-珊、DNA片段-1X和DNA片段-X组成；所述DNA片段-VKDNA片段-VI1、所述DNA片段-珊、所述DNA片段-1X和所述DNA片段-X均为单链DNA片段；所述DNA片段-VI如序列表的序列I的反向互补序列所示，所述DNA片段-VII如序列表的序列2的反向互补序列所示，所述DNA片段-珊如序列表的序列3的反向互补序列所示，所述DNA片段-1X如序列表的序列4的反向互补序列所示，所述DNA片段-X如序列表的序列5的反向互补序列所示。本专利技术还保护所述引物组合物甲或所述引物组合物乙在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为如下(a)或(b):(a)辅助鉴定棉花曲叶病毒；(b)辅助鉴定植物材料中是否含有棉花曲叶病毒。所述植物具体可为扶桑(Hibiscus rosa-sinensis)、番爺(Lycopersicon esculentum)、本生烟(Nicotiana benthamiana)或丰帛花(Chenopodiumquinoa)。所述植物材料具体可为植物叶片本专利技术还保护一种试剂盒，包括所述引物组合物甲或所述引物组合物乙；所述试剂盒的功能为如下(a)或(b): (a)辅助鉴定棉花曲叶病毒；(b)辅助鉴定植物材料中是否含有棉花曲叶病毒。所述植物具体可为扶桑(Hibiscus rosa-sinensis)、番爺(Lycopersiconesculentum)、本生烟(Nicotiana benthamiana)或棉花(Chenopodium quinoa)。所述植物材料具体可为植物叶片。本专利技术还保护所述引物组合物甲或所述引物组合物乙的应用，为如下(a)或(b):Ca)辅助鉴定棉花曲叶病毒；(b)辅助鉴定植物材料中是否含有棉花曲叶病毒。所述植物具体可为扶桑(Hibiscus rosa-sinensis)、番爺(Lycopersicon esculentum)、本生烟(Nicotiana benthamiana)或棉花(Chenopodium quinoa)。所述植物材料具体可为植物叶片本专利技术还保护一种辅助鉴定棉花曲叶病毒的方法，包括如下步骤:(1)以待测病毒的基因组DNA为模板，用所述引物组合物甲或所述引物组合物乙进行环介导等温扩增；(2)通过检测步骤(I)的扩增产物辅助鉴定待测病毒是否为棉花曲叶病毒。本专利技术还保护一种辅助鉴定植物材料中是否含有棉花曲叶病毒的方法，包括如下步骤:(I)以待测植物材料的总DNA为模板，用所述引物组合物甲或所述引物组合物乙进行环介导等温扩增；(2)通过检测步骤(I)的扩增产物辅助鉴定植物材料中是否含有棉花曲叶病毒。基于浊度或沉淀判断结果的原理如下:DNA复制过程中，当一个dNTP分子结合到DNA链上的同时会解离下一个焦磷酸根离子(PPi )，PPi与反应液中的镁离子结合产生白色沉淀Mg2P2O7,由于DNA产物量巨大，随之而来`的副产物Mg2P2O7量很大，因此反应体系会发生浊度变化并可观察到白色沉淀。基于该原理，可在环介导等温扩增的过程中通过实时浊度仪进行结果判断，如果观察到典型的扩增曲线、待测样本为候选的棉花曲叶病毒或被棉花曲叶病毒侵染的植物组织，如果没有观察到典型的扩增曲线、待测样本为候选的非棉花曲叶病毒或没有被棉花曲叶病毒侵染的植物组织。基于该原理，可以根据是否产生白色沉淀进行结果判断，自然光下，如果反应液生成白色浑浊/白色沉淀、待测样本为候选的棉花曲叶病毒或被棉花曲叶病毒侵染的植物组织，如果反应液没有生成白色浑浊/白色沉淀、待测样本为候选的非棉花曲叶病毒或没有被棉花曲叶病毒侵染的植物组织。基于荧光染料的颜色变化判断结果的原理如下:钙黄绿素(鳌合剂)与试剂中的锰离子结合处于淬灭状态，扩增反应的副产物焦磷酸离子与锰离子结合释放钙黄绿素，淬灭状态解除，发出黄绿色荧光。基于该原理，可以根据反应液的颜色变化判断是否有核酸大量合成，从而判断模板是否为靶序列。自然光下，如果反应液由透明橙色变为微浊的黄绿色、待测样本为候选的棉花曲叶病毒或被棉花曲叶病毒侵染的植物组织，如果没有发生上述颜色变化、待测样本为候选的非棉花曲叶病毒或没有被棉花曲叶病毒侵染的植物组织。以上任一所述的环介导等温扩增的反应体系中，F3和B3的浓度具体可为0.2pmol/y L, FIP和BIP的浓度具体可为1.6pmol/y L, LF的浓度具体可本文档来自技高网...
【技术保护点】
引物组合物甲，由DNA片段?Ⅰ、DNA片段?Ⅱ、DNA片段?Ⅲ、DNA片段?Ⅳ和DNA片段?Ⅴ组成；所述DNA片段?Ⅰ、所述DNA片段?Ⅱ、所述DNA片段?Ⅲ、所述DNA片段?Ⅳ和所述DNA片段?Ⅴ均为单链DNA片段；所述DNA片段?Ⅰ如序列表的序列1所示，所述DNA片段?Ⅱ如序列表的序列2所示，所述DNA片段?Ⅲ如序列表的序列3所示，所述DNA片段?Ⅳ如序列表的序列4所示，所述DNA片段?Ⅴ如序列表的序列5所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：赵竹，李明福，张永江，宋云，许瑾，丁小兰，何增磊，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：
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