本发明专利技术涉及免疫治疗领域，具体涉及通过无血清培养扩增活化淋巴细胞的方法，所述方法包括：a)淋巴细胞活化步骤，其中将含有淋巴细胞的生物学样品与包被于培养容器上的淋巴细胞活化剂相接触并在无血清培养基中培养3-6天；b)第一扩增步骤，其中向步骤(a)中获得的培养物加入其体积0.8-1.2倍的无血清培养基，进一步培养1-3天；c)第二扩增步骤，其中向步骤(b)中获得的培养物加入其体积1-1.5倍的无血清培养基，进一步培养1-3天；d)第三扩增步骤，其中向步骤c)中获得的培养物添加其体积2-4倍的无血清培养基，进一步培养4-6天；e)第四扩增步骤，其中向步骤d)中获得的培养物添加其体积0.5-1.5倍的无血清培养基，进一步培养4-6天；和f)收获步骤(e)中获得的扩增的活化淋巴细胞。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及免疫治疗领域，具体涉及，所述方法包括：a)淋巴细胞活化步骤，其中将含有淋巴细胞的生物学样品与包被于培养容器上的淋巴细胞活化剂相接触并在无血清培养基中培养3-6天；b)第一扩增步骤，其中向步骤(a)中获得的培养物加入其体积0.8-1.2倍的无血清培养基，进一步培养1-3天；c)第二扩增步骤，其中向步骤(b)中获得的培养物加入其体积1-1.5倍的无血清培养基，进一步培养1-3天；d)第三扩增步骤，其中向步骤c)中获得的培养物添加其体积2-4倍的无血清培养基，进一步培养4-6天；e)第四扩增步骤，其中向步骤d)中获得的培养物添加其体积0.5-1.5倍的无血清培养基，进一步培养4-6天；和f)收获步骤(e)中获得的扩增的活化淋巴细胞。【专利说明】
本专利技术涉及免疫治疗领域，具体涉及。
技术介绍
过继性细胞免疫治疗是经体外刺激培养淋巴细胞后回输给肿瘤病人，进行肿瘤治疗的方法。自20世纪80年代，细胞因子IL-2对肿瘤的治疗作用被发现，细胞免疫治疗在临床上的应用迅速扩展，人们先后培养出淋巴因子激活的杀伤性细胞(LAK)，肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，细胞因子激活的杀伤性细胞(CIK)。2000年，Yamazaki T等人在柳叶刀杂志(TheLancet)报道了体外扩增活化自体淋巴细胞预防肝癌术后肿瘤复发的随机对照临床实验研究。结果表明这种非特异性免疫治疗极大延长了肝癌患者术后无复发生存时间，而且回输细胞量和杀伤性能与疗效有一定相关性，是一种很有前景的肿瘤治疗方法。在淋巴细胞体外扩增培养中，不同的扩增步骤、不同的培养基以及是否添加血清对于扩增效果具有不同影响，而是否添加血清对提高淋巴细胞的扩增能力和排除临床使用的潜在安全风险至关重要。 本领域需要一种安全、高效、产品稳定性好、适宜于大规模生产的通过无血清培养来扩增活化淋巴细胞的方法。
技术实现思路
本专利技术提供一种，所述方法包括:(a)淋巴细胞活化步骤，其中将含有淋巴细胞的生物学样品与包被于培养容器上的淋巴细胞活化剂相接触并在无血清培养基中培养3-6天；(b)第一扩增步骤，其中向步骤(a)中获得的培养物加入其体积0.8-1.2倍的无血清培养基，进一步培养1-3天；(c)第二扩增步骤，其中向步骤(b)中获得的培养物加入其体积1-1.5倍的无血清培养基，进一步培养1-3天；(d)第三扩增步骤，其中向步骤c)中获得的培养物添加其体积2-4倍的无血清培养基，进一步培养4-6天；(e)第四扩增步骤，其中向步骤d)中获得的培养物添加其体积0.5-1.5倍的无血清培养基，进一步培养4-6天；和(f)收获步骤(e)中获得的扩增的活化淋巴细胞。 在一些实施方案中，本专利技术的方法中使用的淋巴细胞活化剂是抗CD3抗体。在一些实施方案中，本专利技术的方法中步骤(a)-(e)使用相同的无血清培养基。在一些实施方案中，本专利技术的方法中使用的无血清培养基含有细胞因子。所述细胞因子可以包括IL-2、IL-7以及INF--。本专利技术的方法使用的培养基中，IL-2的浓度可以是750-1500U/ml，例如 1000U/ml ;IL_7 的浓度可以是 l_30U/ml，例如 20U/ml ；INF-Y 的浓度可以是750-1500U/ml，例如1000U/ml。优选地，本专利技术的方法中使用的无血清培养基是X-VIV015,TexMACS或MSFlOO培养基。更优选地，所使用的无血清培养基为MSF100培养基。使用本专利技术的扩增活化淋巴细胞的方法，所述生物学样品中的淋巴细胞可被扩增100至1000倍。优选地，其中扩增后的细胞主要为⑶8+T细胞，例如，所扩增的活化淋巴细胞中，CD8+T细胞可>50%。优选地，所扩增的活化淋巴细胞的活力可保持12小时。【专利附图】【附图说明】图1示出扩增活化淋巴细胞的方法流程图。图2示出扩增的活化淋巴细胞活力时间变化曲线图。图3示出五种培养基扩增性能比较和统计学分析。图4示出不同培养基扩增后的细胞表型百分比和统计学分析。【具体实施方式】 本专利技术提供了一种高效扩增活化淋巴细胞的方法，其使用无血清培养基进行培养，安全、高效、产品稳定性好且适宜于大规模生产。优化的培养/扩增步骤本专利技术提供了一种扩增活化淋巴细胞的方法，所述方法包括以下步骤:(a)淋巴细胞活化步骤，其中将含有淋巴细胞的生物学样品与包被于培养容器上的淋巴细胞活化剂相接触并在无血清培养基中培养3-6天；(b)第一扩增步骤，其中向步骤(a)中获得的培养物加入其体积0.8-1.2倍的无血清培养基，进一步培养1-3天；(c)第二扩增步骤，其中向步骤(b)中获得的培养物加入其体积1-1.5倍的无血清培养基，进一步培养1-3天；(d)第三扩增步骤，其中向步骤c)中获得的培养物添加其体积2-4倍的无血清培养基，进一步培养4-6天；(e)第四扩增步骤，其中向步骤d)中获得的培养物添加其体积0.5-1.5倍的无血清培养基，进一步培养4-6天；和(f)收获步骤(e)中获得的扩增的活化淋巴细胞。上述扩增活化淋巴细胞的方法中，培养基添加的次数和体积以及各步骤的培养时间均进行了优化。本专利技术的方法使得可以使用基本上一致的条件和步骤对不同患者来源的样品进行扩增。对于大量样品而言，扩增可以同步进行，从而实现规模化生产。此外，用于扩增的起始细胞原材料一般来自患者外周血，不同性别、年龄和疾病状态的患者会造成培养前细胞差别较大。通过本专利技术的方法进行扩增后，可获得数量和质量相对一致的细胞，符合统一的质量标准，有利于商业上的应用。如实施例1所述，对143例患者的淋巴细胞使用本专利技术的方法扩增，全部获得了高效扩增，扩增倍数为约100-约1000倍，且培养后细胞数量、细胞表型较培养前的变异系数均有明显降低，降低幅度达62?85%(表5)，也即是说使用本专利技术的方法可获得质量较一致的细胞制品。淋巴细朐能够使用本专利技术的方法进行培养和扩增的淋巴细胞可来自外周血淋巴细胞。待扩增的淋巴细胞也可以是其他生物学样品中存在的淋巴细胞，例如上皮淋巴细胞、肿瘤内浸润淋巴细胞、癌性腹水或胸水中的浸润淋巴细胞等。由于外周血中的淋巴细胞分离简便、分离后淋巴细胞生存率高等原因，因此优选地使用分离自新鲜外周血的淋巴细胞。优选地，本专利技术的方法中所述“含有淋巴细胞的生物学样品”是指分离的外周血单个核细胞(PBMC)。从外周血分离PBMC的方法为本领域技术人员所熟知。本专利技术的方法中所使用的初始外周血单个核细胞的量可低至I X IO7?4X IO7个细胞，相当于正常人仅约20ml外周血，扩增后却可以获得IX IO9?12X IO9以杀伤性T细胞为主的淋巴细胞。较低的初始细胞量避免了对患者的大量采血。活化淋巴细朐术语“活化淋巴细胞”是指经特异性抗原或非特异性淋巴细胞刺激剂/分子刺激的淋巴细胞，所述活化淋巴细胞能合成大分子物质(RNA、蛋白质、DNA)及细胞因子。淋巴细胞经活化后进行细胞增殖，并分化为不同功能的子代效应细胞和记忆细胞。术语“淋巴细胞活化剂”是指能够刺激淋巴细胞活化的试剂/分子。例如，可以使用抗CD3抗体作为淋巴细胞活化剂，该试剂刺激T细胞表面的CD3分子，通过T细胞受体有效活化T淋巴细胞。淋巴细胞有丝分裂原是另一类有效的淋巴细胞活化剂。这类分子快速活化淋巴细胞，其作本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种通过无血清培养扩增活化淋巴细胞的方法，所述方法包括：a)淋巴细胞活化步骤，其中将含有淋巴细胞的生物学样品与包被于培养容器上的淋巴细胞活化剂相接触并在无血清培养基中培养3?6天；b)第一扩增步骤，其中向步骤(a)中获得的培养物加入其体积0.8?1.2倍的无血清培养基，进一步培养1?3天；c)第二扩增步骤，其中向步骤(b)中获得的培养物加入其体积1?1.5倍的无血清培养基，进一步培养1?3天；d)第三扩增步骤，其中向步骤c)中获得的培养物添加其体积2?4倍的无血清培养基，进一步培养4?6天；e)第四扩增步骤，其中向步骤d)中获得的培养物添加其体积0.5?1.5倍的无血清培养基，进一步培养4?6天；和f)收获步骤(e)中获得的扩增的活化淋巴细胞。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：邵谊，
申请(专利权)人：北京赛诺泰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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