本发明专利技术涉及一种具有改善体内功效和稳定性持续时间作用的促胰岛素肽缀合物，该肽缀合物包括促胰岛素肽，非肽聚合物和免疫球蛋白Fc区，它们以共价键相互连接，本发明专利技术还涉及该肽的缀合物的用途。本发明专利技术的促胰岛素肽缀合物具有相对高的体内活性，并显著增加血液半衰期，因此它可以如愿地用于各种肽类药物的长效配方的开发。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及一种具有改善体内功效和稳定性持续时间作用的促胰岛素肽缀合物，该肽缀合物包括促胰岛素肽，非肽聚合物和免疫球蛋白Fc区，它们以共价键相互连接，本专利技术还涉及该肽的缀合物的用途。本专利技术的促胰岛素肽缀合物具有相对高的体内活性，并显著增加血液半衰期，因此它可以如愿地用于各种肽类药物的长效配方的开发。【专利说明】使用免疫球蛋白片段的促胰岛素缀合物本申请是于2008年I月4日提交的申请号为2008800017664，专利技术名称为“使用免疫球蛋白片段的促胰岛素缀合物”的专利技术专利申请的分案申请。
本专利技术涉及一种用于促胰岛素肽的长效配方的促胰岛素肽缀合物。具体地，本专利技术涉及一种显著提高体内功效持续时间的改良的促胰岛素肽的缀合物，该肽缀合物是通过将促胰岛素肽和非肽聚合物以及免疫球蛋白Fe共价连接产生的，以及本专利技术还涉及该肽缀合物的制备方法。
技术介绍
肽由于它们的低稳定性而容易变性，由体内的蛋白水解酶降解，从而失去活性，并且肽具有相对较小，从而容易通过肾。因此，为了保持血液浓度和包括作为药物有效成分的肽的药物浓度，必须给病人频繁地服用肽类药物来保持所需要的血液浓度和药物浓度。然而，该肽类药物通常以注射剂的形式给药，而这样频繁的给药使得病人很痛苦。为解决这些问题，已经进行了许多努力。作为其中的一种努力，已经尝试通过生物膜增加肽类药物的传送以通过口咽或鼻咽吸入来运送肽类药物。然而，与注射相比，由于体内的传送效率低，这种方法仍然很难保持该肽类药物的体内活性。另一方面，已经进行了很多努力来改善肽类药物的血液稳定性，并将药物在血液中以高浓度保持长时间，从而使该药物的药效最大化。因此，这种肽类药物的长效制剂需要增加肽类药物的稳定性 ，并保持不会引起病人免疫反应的足够高浓度的药物浓度。作为稳定肽并抑制它通过蛋白水解酶降解的方法，已经进行了一些实验来修饰对该蛋白水解酶敏感的特定氨基酸序列。例如，由于GLP-1 (7-37或7-36酰胺)通过二肽基肽酶IV (DPP IV)在第8氨基酸(Ala)和第9氨基酸(Asp)之间进行剪切而损失了 GLP-1的药物浓度，因此具有减少血液中葡萄糖浓度以治疗2型糖尿病作用的GLP-1 (7-37或7_36酰胺)具有4分钟或更短的生理活性的半衰期(Kreymann等，1987)。因此，已经进行了各种关于具有抗DPP IV的GLP-1类似物的研究，并且已经进行了用Gly取代Ala (Deacon等，1998 ；Burcelin 等，1999)或用 Leu 或 D-Ala 取代 Ala ( (Xiao 等，2001))的实验,从而在保持它的活性的同时增加了对DPP IV的抗性。GLP-1的N末端氨基酸，His7对GLP-1的活性是重要的，并且作为DPP IV的目标。因此，美国专利第5，545，618号描述了用烷基或酰基修饰N末端，并且GalIwitz等描述了第7位His进行N甲基化或a甲基化，或者整个His用咪唑取代来增加对DPP IV的抗性并保持生理活性。除了这些修饰,从希拉毒蜥蜴的唾液腺纯化的GLP-1类似物exendin_4(美国专利第5，424，686号)具有对DPP IV的抗性并比GLP-1具有更高的生理活性。因此，它具有比GLP-1的半衰期更长的2至4小时的体内半衰期。然而，仅使用增加DPP IV抗性的方法，生理活性不能被充分地保持，并且在使用商业可获得的exendin-4 (exenatide)的情况下,它需要一天两次被注射给病人，这对病人仍然是很痛苦的。这些促胰岛素肽具有一个问题，通常肽的大小很小。从而，它们不能在肾中被重新获得，并且它们随后被排出体外。因此，已经使用以化学方法在肽的表面添加例如聚乙二醇(PEG)的具有高溶解度的聚合物来抑制在肾中的损失的方法。PEG非特异性地结合到特异位点或目标肽的多个位点产生了增加肽的分子量的效果，并从而抑制通过肾的损失，并防止水解，而不产生任何的副作用。例如，国际专利公开第W02006/076471号申请描述了 PEG结合到B型利钠肽或BNP, BNP结合到NPR-A激活cGMP的产生，cGMP使得动脉血压降低，并因此作为充血性心力衰竭的治疗剂，从而保持生理活性。美国专利第6，924，64号描述了 PEG结合到exendin-4的赖氨酸残基来增加它的体内停留时间。然而，这种方法增加了 PEG的分子量，从而增加了肽类药物的体内停留时间，同时随着分子量的增加，该肽类药物的浓度显著地减少了，并且肽的反应性也降低了。因此，产量被不希望的降低了。国际专利公开第W002/46227号申请描述了使用基因重组技术通过将GLP-1，exendin-4或其类似物与人血清白蛋白或免疫球蛋白区(Fe )结合来制备融合蛋白。美国专利第6，756，480号描述了通过将甲状旁腺激素(PTH)和其类似物与Fe区结合来制备Fe融合蛋白。这些方法可以解决如聚乙二醇化产量低和非特异性的问题，但是它们仍然具有这样一个问题，即增加血液中半衰期的效果不像期待中的那么显著，并且有时浓度也很低。为了使增加血液中半衰期的效果最大化，使用了各种类型的肽连结器，但是可能引起免疫反应。此外，如果肽具有二硫键，例如使用BNP，那么错折叠的概率很高。因此，这类肽几乎不可能被使用。此外，GLP-1衍生物即NN2211是通过取代GLP-1的氨基酸并被结合到酰基侧链以形成与白蛋白的非共价键来制备的，从而增加了它的体内停留时间。然而，它具有11至15小时的半衰期，与exendin-4相比，它没有显示出半衰期的显著增加。从而，GLP-1衍生物仍然需要一天一次地被注射(Nauck等，2004)。此外，CJC-1131是GLP-1衍生物，它具有将GLP-1和血液中的白蛋 白共价结合的马来酰亚胺反应基团，并且为了达到增加体内半衰期的目的，已经努力进行实验来开发CJC-1131，但是这些努力现在已经停了下来。其后被提议的物质CJC-1134是共价结合到重组白蛋白的exendin-4，并且没有显示增加血液稳定性的显著效果，它具有17小时的血液半衰期(鼠)(Thibauoleau等，2006)。
技术实现思路
技术问题因此，本专利技术人将免疫球蛋白Fe和非肽聚合物与非N末端的氨基酸残基处通过共价键连接到促胰岛素肽的特异性位点，并发现本专利技术的缀合物具有显著的增加体内功效和半衰期的用途。特别地，他们发现，在促胰岛素肽的缀合物中，肽的缀合物例如exendin-4，exendin-4的N末端氨基被敲除的去-氨基-组氨酰-exendin-4, exendin-4的N末端氨基被轻基取代的β -轻基-咪唑-丙酰基-exendin-4, exendin-4的N末端氨基用两个甲基基团修饰的二甲基-组氨酰-exendin-4和第一个组氨酸的α碳和N末端氨基均被敲除的咪唑-乙酰基-exendin-4都产生显著的增加的体内功效和半衰期的作用。技术方案本专利技术的一个目的是提供一种促胰岛素肽的长效制剂，它具有保持该促胰岛素肽的体内活性并增加血液半衰期的作用。附图简述图1显示了测定天然eXendin-4(N)-PEG-免疫球蛋白Fe缀合物纯度的反相HPLC的结果；图2显示了测定天然exendin-4 (Lys) -PEG-免疫球蛋白F本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种促胰岛素肽缀合物，所述缀合物含有通过非肽聚合物连接的促胰岛素肽和免疫球蛋白Fc区，其中所述的促胰岛素肽是通过用羟基取代exendin?4的N末端氨基制备的β?羟基?咪唑?丙酰基?exendin?4，其中所述的非肽聚合物选自包括聚乙二醇，聚丙二醇，乙二醇和丙二醇共聚物，聚氧乙烯化的多元醇，聚乙烯醇，多糖，葡聚糖，聚乙烯基乙醚，生物可降解的聚合物，脂类聚合物，几丁质，透明质酸和它们组合的组，并且，其中所述非肽聚合物的一个末端与所述促胰岛素肽的非N末端的氨基酸残基连接。
【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：宋大海，林昌基，宋台宪，金永勳，权世昌，李宽淳，郑圣烨，崔仁荣，
申请(专利权)人：韩美科学株式会社，
类型：发明
国别省市：
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