裂殖酵母属酵母的转化体、该转化体的制造方法、β-葡糖苷酶的制造方法及纤维素的降解方法技术

本发明专利技术的目的在于提供可产生葡糖苷酶活性经改良的修饰型β-葡糖苷酶的裂殖酵母属酵母的转化体、该转化体的制造方法、该修饰型β-葡糖苷酶的制造方法及采用该修饰型β-葡糖苷酶的纤维素的降解方法。裂殖酵母属酵母的转化体，其特征在于，在染色体中或作为染色体外基因具有包括编码向来源于丝状菌的β-葡糖苷酶中导入了特定变异组中的至少一种变异的修饰型β-葡糖苷酶的区域的结构基因序列以及用于使该结构基因表达的启动子序列和终止子序列，所述修饰型β-葡糖苷酶的热稳定性或耐葡萄糖抑制性比不具有所述特定变异的β-葡糖苷酶高。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术的目的在于提供可产生葡糖苷酶活性经改良的修饰型β-葡糖苷酶的裂殖酵母属酵母的转化体、该转化体的制造方法、该修饰型β-葡糖苷酶的制造方法及采用该修饰型β-葡糖苷酶的纤维素的降解方法。裂殖酵母属酵母的转化体，其特征在于，在染色体中或作为染色体外基因具有包括编码向来源于丝状菌的β-葡糖苷酶中导入了特定变异组中的至少一种变异的修饰型β-葡糖苷酶的区域的结构基因序列以及用于使该结构基因表达的启动子序列和终止子序列，所述修饰型β-葡糖苷酶的热稳定性或耐葡萄糖抑制性比不具有所述特定变异的β-葡糖苷酶高。【专利说明】裂殖酵母属酵母的转化体、该转化体的制造方法、P -葡糖苷酶的制造方法及纤维素的降解方法
本专利技术涉及裂殖酵母(Schizosaccharomyces)属酵母的转化体、该转化体的制造方法、使用该转化体的￠-葡糖苷酶的制造方法及采用该￠-葡糖苷酶的纤维素的降解方法。具体来说，涉及可生产热稳定性或耐葡萄糖抑制性比野生型的3-葡糖苷酶高的修饰型的3-葡糖苷酶的裂殖酵母属酵母的转化体及其制造方法。
技术介绍
为了由木材或稻草、稻壳、杂草等纤维素类生物质生产作为发酵原料的糖并进而生产生物乙醇等生物质燃料，必须降解作为植物细胞壁的主要构成成分的纤维素。纤维素的降解有浓硫酸糖化法或稀硫酸糖化法等酸糖化法、利用酶的酶糖化法等方法，在近年来生物技术迅猛发展的背景下，进行了大量酶糖化法的研究开发。纤维素的酶糖化利用被总称为纤维素酶的一类酶。首先，具有随机切断纤维素链的活性的内切葡聚糖酶(EG)将纤维素的非晶体区域降解，使葡萄糖末端露出。露出的葡萄糖末端被纤维二糖水解酶(CBH)降解，纤维二糖游离。接着，￠-葡糖苷酶(BGL)将游离的纤维二糖降解，从而葡萄糖游离。纤维素的酶糖化中广泛采用曲霉属和木霉属等的丝状菌。这是因为可生产用于将结晶纤维素降解而糖化的各种纤维素酶和半纤维素酶，并可将这些酶大量分泌至细胞外。此外，也进行了通过异种株表达这些丝状菌的纤维素酶的尝试。此外，非专利文献I中揭示了通过编码作为丝状菌之一的棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)的P -葡糖苷酶I (BGL I )的基因对作为出芽酵母的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)进行转化，使所得的转化体表达了这些酶。另一方面，与曲 霉属和木霉属相比，裂殖酵母属酵母的基因分析更深入，具有确立了各种有用的变异株和基因导入用载体、适合于蛋白质的工业化大量生产的优点。然而，裂殖酵母属酵母不具有固有的3 -葡糖苷酶基因，无法对纤维二糖进行同化。另外，还期待￠-葡糖苷酶本身的高功能化。例如，酶糖化法的情况下，存在下述问题:如果葡萄糖随着基于酶的纤维素的水解反应进行而在反应体系内积聚，积聚的葡萄糖会抑制3 -葡糖苷酶，纤维二糖积聚，进而积聚的纤维二糖抑制内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶，结果纤维素无法完全降解。因此，希望开发出耐葡萄糖抑制性(葡萄糖抑制的耐受性)更高的￠-葡糖苷酶。此外，酶反应一般存在反应温度越高则反应效率越高的倾向，因此通过提高纤维素降解反应时的温度，可期待更高效地降解纤维素。另外，热稳定性越高，酶反应的持续时间可越长。因为，希望开发出热稳定性更高的￠-葡糖苷酶。对酶的随机变异导入法在改良该酶的功能的方面是重要的方法之一。易错PCR(聚合酶链式反应)法(非专利文献2)等中，向目标基因导入随机的单碱基置换变异。通过饱和变异导入法(非专利文献2)随机改变特定部位的密码子。通过体外重组法(非专利文献2)，将多个变异体的基因杂交而组合变异点。通过这些随机变异导入法向编码目标酶的基因导入随机变异，从而可制成变异酶文库。通过使用可从其中选择符合目标功能的筛选法进行选择，可获得有用的改良酶。另外，通过反复进行随机变异和筛选，可积累有用的变异点，使酶的功能进一步提高。然而，基于随机变异导入的酶的改良大部分是大肠杆菌(专利文献I)和无细胞蛋白质合成系(专利文献2)中的事例，不适合于来源于真核生物的糖蛋白的变异导入。此外，专利文献3中对出芽酵母进行随机变异导入，但有变异基因向载体的插入和大肠杆菌中的变异基因插入载体的扩增和纯化的工序，不够简便。现有技术文献专利文献专利文献1:日本专利特许第4402446号公报专利文献2:日本专利特开2005-245336号公报专利文献3: 日本专利特许第4448772号公报非专利文献非专利文献1:G.Tanaka 等,Biosc1.Biotechnol.Biochem.，(1998)62(8)，1615-1618 页?非专利文献2:F.Arnold等，《定向进化文库的构建方法及实验方案(DirectedEvolution Library Creation Methods and Protocols)》，《分子生物学方法(Methods inMolecular Biology))), (2003) 231 卷.专利技术的概要专利技术所要解决的技术问题于是，本专利技术的目的在于提供可产生葡糖苷酶活性经改良的修饰型P -葡糖苷酶的裂殖酵母属酵母的转化体、该转化体的制造方法、该修饰型3 -葡糖苷酶的制造方法及采用该修饰型￠-葡糖苷酶的纤维素的降解方法。解决技术问题所采用的技术方案本专利技术人为了解决上述课题而认真研究后，发现通过将向来源于丝状菌的编码^-葡糖苷酶的结构基因序列导入特定变异而合成的编码修饰型P-葡糖苷酶的结构基因导入裂殖酵母属酵母进行转化，可解决上述课题，从而完成了本专利技术。SP，本专利技术提供以下的?。裂殖酵母(schizosaccharomyces)属酵母的转化体，其中，在染色体中或作为染色体外基因具有包括编码下述修饰型￠-葡糖苷酶的区域的结构基因序列以及用于使该结构基因表达的启动子序列和终止子序列；修饰型P -葡糖苷酶:作为存在选自下述变异I?变异6的至少一种变异的来源于丝状菌的3 -葡糖苷酶，热稳定性或耐葡萄糖抑制性比不具有所述变异的来源于丝状菌的@-葡糖苷酶高的P-葡糖苷酶；变异1:与位于 AaBGLl (棘抱曲霉(Aspergillus aculeatus)的 BGLI)的第 244个的异亮氨酸对应的氨基酸被置换为苯丙氨酸的变异；变异2:与位于AaBGLl的第282个的甘氨酸对应的氨基酸被置换为苯丙氨酸的变巳升；变异3:与位于AaBGLl的第442个的天门冬酰胺对应的氨基酸被置换为丝氨酸的变异；变异4:与位于AaBGLl的第452个的甘氨酸对应的氨基酸被置换为丝氨酸的变巳升；变异5:与位于AaBGLl的第503个的缬氨酸对应的氨基酸被置换为丙氨酸的变巳升；变异6:与位于AaBGLl的第613个的精氨酸对应的氨基酸被置换为亮氨酸的变巳如上述所述的转化体，其中，所述来源于丝状菌的@ -葡糖苷酶为BGLl。如上述或所述的转化体,其中，所述丝状菌为曲霉(Aspergillus)属的微生物。如上述?中的任一项所述的转化体，其中，所述来源于丝状菌的葡糖苷酶是与以序列编号I表示的氨基酸序列的同源率在70%以上且具有催化^ -D-吡喃葡萄糖苷键的水解反应的活性的蛋白质。如上述?中的任一项所述的转化体，其中，所述结构基因序列在编码所述修饰型P -葡糖苷酶的区域的5’末端侧和3’末端侧的至少任一本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：冈田和士，东田英毅，
申请(专利权)人：旭硝子株式会社，
类型：
国别省市：