本发明专利技术公开了一种5S?rDNA在植物染色体上的荧光原位杂交方法，它主要包括染色体标本制备、5S?rDNA探针制备、染色体荧光原位杂交、杂交信号检测等步骤，重点解决了现有荧光原位杂交探针的标记复杂繁琐的方法，提供一种简便、快速、准确的探针标记和杂交方法，利用这种技术能够在三小时内完成5S?rDNA在染色体上的FISH定位。本发明专利技术的探针为寡核苷酸探针在合成时可加入荧光基团修饰，不用再进行标记，与现有技术相比方法简单、成本低廉。
【技术实现步骤摘要】
【技术保护点】
一种5S?rDNA在植物染色体上的荧光原位杂交方法，其特征在于按如下的步骤进行：染色体标本制备（1）按常规植物材料培养，待种子或植株根尖长至0.5?1cm；（2）切下生长旺盛的根尖，用饱和对二氯苯溶液室温下预处理3?5小时；（3）吸去预处理液，根尖用蒸馏水或0.075mol/L?氯化钾低渗30min，然后用3:1（甲醇:冰醋酸）固定20min?1小时；（4）用蒸馏水洗三次，每次5min，充分洗去固定液；（5）用果胶酶和纤维素酶按重量分数比1:1混合的酶2.5%（w/w），在37℃解离根尖1小时；?（6）蒸馏水洗去酶液，用0.075mol/L?氯化钾后低渗15?30min，用3:1甲醇：冰醋酸固定液固定20min；（7）取根尖于预先在4℃蒸馏水中冷冻的洁净载玻片上，滴一滴固定液，用镊子将根尖充分捣碎，再加1滴固定液，将细胞吹散，空气干燥；（8）用1:30稀释的Giemsa染色液染色10min，自来水冲洗凉干；（9）镜检，选择分散良好的染色体标本放在?20℃冰箱中保存待用；5S?rDNA探针制备从拟南芥5S?rDNA序列中选取一段20个碱基左右的高度保守序列，合成时在探针的5’或3’端连接一个荧光基团：5’??CTGATGGGATCCGGTGCTTT??3’?，5’端带红色荧光标记TAMRA；染色体荧光原位杂交：A：染色体标本预处理?（1）在荧光显微镜上记下已标记分裂相的坐标，并用玻璃刀在载玻片背面标记分裂相的位置；（2）将载玻片在45%醋酸中浸泡5min褪色，空气干燥；B：染色体标本变性（1）?在标记处加30μL?70%去离子甲酰胺/2×SSC，盖上盖玻片，于PCR仪或烘箱中70℃处理2min；（2）去掉盖片，?20℃的70%、85%、100%冷乙醇脱水，每级3min，空气干燥；C：杂交?（1）用2×SSC稀释探针至5ng/μL；（2）每张标本加10μL探针，并盖18×18mm的盖玻片；（3）于湿盒中37℃杂交1?2小时；D：杂交后洗脱?（1）在4×SSC，0.2%Tween?20中室温下避光洗涤10min；（2）蒸馏水冲洗片刻，避光空气干燥；E：杂交信号检测?（1）滴加3μL含有DAPI的防荧光淬灭剂，盖上盖玻片；（2）Nikon?80i荧光显微镜观察，按照所记录的标本坐标在紫外光激发下可观察到蓝色的染色体，在绿色激发光激发下可观察到红色的5S?rDNA杂交信号；（3）SPOT?RT?KE冷CCD进行图像采集，SPOT?4.1软件进行图像合成。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈成彬，王春国，宋文芹，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：
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