一种克隆绵羊Notch1基因胞内结构域NICD的方法技术

技术编号:9378365 阅读:193 留言:0更新日期:2013-11-27 20:49
本发明专利技术提供的一种克隆绵羊Notch1基因胞内结构域NICD的方法,收集胎羊,利用Trizol法提取腹部组织总RNA,将总RNA反转录成cDNA;设计引物,并在两端添加酶切位点及His标签序列:上游引物P1:5’-GTCCGGATCCACTTCATGTACGTGGCCGTGGTGG-3’,下游引物P2:5’-CCTGACGCGTTTAGTGATGGTGATGGTGATGCTTGAATGCCTCCGGGACGTG-3’;用cDNA为模板进行PCR扩增NICD片段;PCR产物经过BamHI和MluI双酶切;回收产物与pLex-mcs慢病毒表达载体进行连接,进行克隆并利用脂质体转染入293T细胞中,通过western?blot检测NICD的表达,验证克隆序列的正确性。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种克隆绵羊Notch1基因胞内结构域NICD的方法,其特征在于:分步实施;1)从屠宰场收集刚死亡1月龄胎羊,冻存于液氮中,利用Trizol法提取腹部组织总RNA,将总RNA反转录成cDNA;2)设计引物:用人的NICD结构域5’起始端和3’终止端序列BLAST,比对绵羊全基因组序列,依据比对结果,确定绵羊NICD在基因组上5’和3’端位置,设计特异性引物,并在两端添加酶切位点及His标签序列:上游引物P1:?5“?GTCCGGATCCACTTCATGTACGTGGCCGTGGTGG?3’,下游引物P2:?5’?CCTGACGCGTTTAGTGATGGTGATGGTGATGCTTGAATGCCTCCGGGACGTG?3’;3)用cDNA为模板进行PCR扩增NICD片段;PCR扩增体系:2.5U/μL?PrimerStar?DNA?Polymerse?5μL,5×PS?buffer?5μL,2.5mmol/L?dNTP?2μL,10pmol/μL上下游引物各0.5μL,cDNA模板4μL,ddH2O补至25μL;反应程序:预变性98℃,4min;变性98℃,10sec;退火60℃,15sec;延伸72℃,3min?35个循环;72℃,10min;4)PCR?产物经过BamHI和MluI双酶切,后进行胶回收纯化;5)回收产物与pLex?mcs慢病毒表达载体进行连接,转化DH5α感受态细胞,进行克隆;6)将克隆好的绵羊NICD慢病毒表达载体,利用脂质体转染入293T细胞中,通过western?blot检测NICD的表达,验证克隆序列的正确性。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员:刘晨曦刘明军李文蓉陈红玲唐森
申请(专利权)人:新疆维吾尔自治区畜牧科学院中国澳大利亚绵羊育种研究中心
类型:发明
国别省市:

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