一种酪氨酰tRNA 合成酶突变体的制备方法及应用技术

本发明专利技术属生物技术领域，涉及一种酪氨酰tRNA合成酶突变体的制备方法及应用；具体涉及一种酪氨酰tRNA合成酶突变体的制备方法及其在放疗、化疗后辅助治疗的应用。本发明专利技术所述制备方法简单、快捷，适于产业化生产；此外，本发明专利技术的药效学研究，结果表明，所述酪氨酰tRNA合成酶突变体可用于治疗肿瘤放、化疗诱导的血小板减少症。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种酪氨酰tRNA?合成酶突变体的制备方法，其特征在于，步骤包括：（1）工程菌高密度发酵工程菌复苏及摇瓶接种：取出原始祖种子菌，100?级洁净度条件下，在?LBK?平板上接种，37℃?培养?2?3?天；从平板上挑取单菌落，100?级洁净度条件下接种于?20ml?含?50?μg/ml?kanamycin?LB培养液中，30℃?振摇培养?8?小时，至?OD600?为?2，制得一级种子液；将上述一级种子液加入?300?ml?LBK?培液中，30℃?振摇培养?6?小时，至?OD600?为?2，制得二级种子液；（2）发酵罐及?Sl?培养基高压灭菌清洗发酵罐，安装好各个管道，按校正程序进行?pH?校正，加入?3.2?L?S1?培养基，121℃?1.5kg/cm2?高压灭菌?20?min，冷却至室温；溶氧DO?电极校正和设定各种参数，发酵罐温度设定为?30℃；无菌条件下，向发酵罐中加入?S2、S3、S4?和?S5培养基；通入纯氧，搅拌速度设定为?500?rpm，待?DO?稳定后，按?DO?校正程序将此时?DO?值设定为?100%；（3）二级种子液接种培养及?IPTG?诱导酪氨酰?tRNA?合成酶突变体表达在无菌条件下，将所述二级种子液接种入发酵罐内，通入空气，进行扩增培养；每隔?1?h?取样?5ml，测定?OD600;控制?DO?50%±10%，观察?pH、温度、搅拌转速；pH?以氨水调节，随时流加适量消泡剂；至?OD600?30，加入?IPTG?诱导?6?小时，停止发酵，4000?rpm?×?20?min?离心，收集菌体；工程菌在发酵罐内生长至?OD600?30，加入?IPTG?，终浓度为?0.5?Mol/L，诱导目的蛋白表达，诱导?6?小时后，表达量占全菌总蛋白的?50%，每升培液收获湿菌?100g；（4）纯化酪氨酰?tRNA?合成酶突变体①高压破菌菌体用醋酸缓冲液以?1:10?w/v?重悬，将混悬液倒入均质机，300?bar?压力下，完成均质，1000?bar?压力下，完成破菌；10,000?rpm?×?30?min?离心，分离上清；②阳离子交换层析，洁净度?10000?级，4℃层析柱规格为?12.5?cm?×?40?cm，填料为?SP?Sepharose?Fast?Flow，纯化使用?AKTA?Explore?系统完成，用NaAc?HAc平衡，将上述分离得到的上清上样，流速?15ml/min；用?NaAc?HAc?冲洗至?OD280?达到基线，流速?15ml/min，用?NaAc?HAc?NaCl线性梯度洗脱，流速?15ml/min，监测?OD280，收集活性组份；③凝胶过滤层析，洁净度?10000?级，4℃层析柱规格为?12.5?cm?×?100?cm，填料为?SephadexG?50，纯化使用?AKTA?Explore?系统完成，用?0.02Mol/L?PB?平衡，将经过阳离子交换层析收集的样品自动进样，用?0.02?Mol/L?PB?洗脱，流速?10ml/min，监测?OD280，收集活性组份；④阴离子交换层析，洁净度?10000?级，4℃层析柱规格为2.6?cm?×?10?cm，填料为?Q?sepharose?Fast?Flow，纯化使用AKTA?Explore?系统完成，用?0.02?Mol/L?PB?平衡，经凝胶过滤层析收集的组份上样，流速?15?ml/min，收集上样峰组分；一次发酵，纯化工艺如下表所示：1?次?5L?规模的发酵，收集菌体?100g，经?3?步纯化，获得纯度?＞?95%?的?酪氨酰?tRNA?合成酶突变体?蛋白?350?mg；??体积(L)蛋白浓度(mg/ml)蛋白总量(mg)回收率(%)发酵收集菌体100g(重悬1L)1.0mg/ml1000mg0阳离子交换层析0.2L2.0mg/ml400mg40%凝胶过滤层析0.3L1.33mg/ml400mg40%阴离子交换层析0.15L2.33mg/ml350mg35%。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：莫炜，于敏，詹领，郎永江，张艳玲，包志宏，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：