用于基因导入的病毒载体的制造方法技术

本发明专利技术公开了作为感染F基因缺陷型病毒的宿主细胞、可恒定地稳定地表达F蛋白的细胞系，以及利用此类细胞制造F基因缺陷型病毒的方法。非增殖型人副流感2型病毒载体是通过下述方法制造的：将F基因缺陷的人副流感2型病毒与Vero细胞共培养，所述Vero细胞以非诱导性表达的形式具有人副流感2型病毒的F基因，然后从培养上清液中分离病毒颗粒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于基因导入的病毒载体的制造方法相关申请本申请基于日本专利申请2011-025234(2011年2月8日申请)主张优先权，日本专利申请2011-025234的内容通过参考并入本申请。
本专利技术涉及用于基因导入的病毒载体的制造方法。
技术介绍
因为人副流感2型病毒(humanparainfluenzatype2virus)(hPIV2)有可能感染人气管粘膜、诱导粘膜免疫，故而期待其作为疫苗用载体应用。为了将该载体作为医药品实用化，必须使得病毒载体具有感染人细胞的能力、且感染后在人体内不产生传播性病毒(表示为非增殖性载体)。即，对细胞·组织进行单次感染，但在感染细胞·组织中不产生传播性病毒、不引起多次感染的系统是必要的。为了构建该系统，通常采用下述系统：使得病毒基因组上的基因一部分缺陷、制造表达该缺陷基因产物的细胞、通过在该细胞中向缺陷型病毒反式供给缺陷基因产物、制作非增殖型载体。对于DNA病毒，向腺病毒中导入了该系统(例如WO94/28152)，对于RNA病毒，向逆病毒中导入了该系统(例如WO2006/084746)。另外，关于人副流感2型病毒所属的副粘病毒科病毒，提出了F基因等缺陷的仙台病毒载体(WO2000/070070)。另外，有报道称，发现下述结核发病预防疫苗具有强的结核菌增殖抑制效果，所述结核发病预防疫苗使用引入了来自定型抗酸菌的堪萨斯分枝杆菌(Mycobacteriumkansasii)或牛结核杆菌(Mycobacteriumbovis)BCG的α抗原(Ag85B)基因的人副流感病毒2型病毒的非增殖性基因重组型载体(PCT/JP2010/069435)。F基因缺陷型人副流感2型病毒不存在人副流感2型病毒的融合蛋白(以下记为“F蛋白”)，该融合蛋白是单独通过侵入宿主细胞后的该病毒的复制·转录步骤、使病毒包膜与细胞膜融合、向宿主内导入病毒核壳蛋白时所必需的，因此，F基因缺陷型人副流感2型病毒不能构成保持自主增殖能力的病毒颗粒。因此，就制备虽然基因组上F基因缺陷、但载体包膜上含有F蛋白的非增殖型人副流感2型病毒载体而言，通过制造表达该病毒F蛋白的细胞、在该细胞中培养该缺陷型病毒，在从该细胞反式供给的F蛋白存在的情况下，使得F蛋白保持于病毒包膜上，从而构建具有感染能力的病毒颗粒。从通过该增殖系统制备的培养上清液回收的人副流感2型病毒颗粒的基因组中，F基因是缺失的。当预先向该F基因缺陷型人副流感2型病毒载体中引入治疗用基因、编码疫苗抗原的基因时，可获得作为医药品有用的病毒颗粒。一般情况下病毒的膜蛋白质具有细胞毒性，因此以往必须要通过导入以病毒F基因等在诱导型启动子控制下表达的方式设计的载体来建立细胞株，平常时抑制F基因等的表达，仅在病毒感染表达F基因等的辅助细胞而被重构时才使得F基因等被诱导表达。例如，与上述仙台病毒载体相关的现有技术文献(WO2000/070070)中，使用了下述系统：其中使用Cre-loxP诱导系统，宿主细胞增殖时仙台病毒的F基因不表达，通过在细胞感染病毒时添加腺病毒来诱导表达。但是，在病毒载体的商业制造中，必须有准备并添加腺病毒的步骤，故操作烦杂，另外，通过腺病毒的基因导入效率也不是一定的，因此存在医药品制造管理步骤复杂的问题。并且，在实际使用膜蛋白质的表达诱导系统制造病毒载体的步骤中，培养细胞使得病毒颗粒增殖的情况下，存在下述问题：因为表达膜蛋白质具有毒性，随着对宿主细胞进行传代，病毒的增殖能力降低，经约5代的传代，病毒的产生能力就基本消失了。因此，作为能表达编码病毒中缺陷的膜蛋白质等的基因、且使缺陷型病毒载体增殖的细胞，人们在寻求能恒定地稳定地表达该蛋白的细胞系。并且，人们在寻求传代之后性质不变、具有牢靠性的宿主细胞系。本说明书中引用的参考文献如下文所示。这些文献中记载的内容均通过参考并入本说明书。这些文献均不被认为是相对于本说明书的现有技术。专利文献1：WO94/28152专利文献2：WO2006/084746专利文献3：WO2000/070070专利文献4：PCT/JP2010/069435
技术实现思路
本专利技术的目的在于作为使人副流感2型病毒的F基因缺陷的病毒增殖的细胞，提供一种能恒定地稳定地表达人副流感2型病毒的F蛋白的细胞系，以及提供利用上述细胞制造F基因缺陷型人副流感2型病毒载体的方法。本专利技术的专利技术人等发现Vero细胞作为能感染人副流感病毒2型病毒F基因缺陷型病毒、产生病毒颗粒的包装细胞，具有优秀的性质。出人意料地确认到，Vero细胞对人副流感2型病毒F蛋白的容许性特别高，另外不表达干扰素，即使在使得人副流感2型病毒的F基因恒定表达的情况下也能稳定增殖，并且能高效产生病毒颗粒。即，本专利技术提供了非增殖型人副流感2型病毒载体的制造方法。该方法包括下述各步骤：将F基因缺陷的人副流感2型病毒与Vero细胞共培养，所述Vero细胞具有非诱导性表达人副流感2型病毒的F基因的形式，然后从培养上清液中分离病毒颗粒。本专利技术的方法的优选的实施方式中，向F基因缺陷的人副流感2型病毒的基因中引入疫苗用基因或治疗用基因。根据其他观点，本专利技术提供了以非诱导性表达的形式具有人副流感2型病毒的F基因的Vero细胞。通过使用本专利技术的方法，能稳定、高效地制造非增殖型的人副流感2型病毒载体。附图说明[图1]图1表示人副流感2型病毒的颗粒构造及基因组。[图2]图2表示：通过RT-PCR法确认到在长期培养后(1年左右)的F基因表达Vero细胞中F基因表达，F基因的表达被维持。[图3]图3表示Western印迹图，其中确认到在F基因导入Vero细胞中F蛋白表达。[图4]图4表示含有人副流感2型病毒(缺失F基因)的反义基因组cDNA及GFP基因的质粒结构的一部分。[图5]图5表示Western印迹图，其中确认到保持有M2基因、F基因缺陷的hPIV2表达M2蛋白。具体实施方式本专利技术提供了使用Vero细胞(以非诱导性表达的形式具有人副流感2型病毒的F基因)、使F基因缺陷的人副流感2型病毒增殖的方法。人副流感2型病毒是属于副粘病毒科的病毒，其基因组为约15,000个碱基的单顺反子单链负RNA。图1示出了人副流感2型病毒(hPIV2)的基本颗粒结构。核壳蛋白(NP)结合至该核酸，形成螺旋对称核糖核苷蛋白复合体(核壳RNP)。病毒基因组编码的蛋白质中，NP蛋白、P(磷酸)蛋白及L(大，Large)蛋白是RNP的形成所必需的。F(融合)蛋白及HN(血细胞凝集素·神经氨酸酶)蛋白是包膜蛋白，其对于对细胞的感染来说是重要的。M(基质)蛋白是支持包膜结构的膜蛋白。人副流感2型病毒是在感染细胞的细胞质中增殖的RNA病毒，因此基因不被引入宿主细胞的染色体中。另外，已知该病毒感染人气管粘膜、通过诱导IgA的表达从而诱导粘膜免疫，并且迄今为止没有成人的重症报道病例，故而考虑将其作为疫苗用病毒载体或治疗用病毒载体是极为有用的。将人副流感2型病毒改变为表达NP蛋白、P蛋白及L蛋白、但不表达F蛋白时，病毒颗粒能感染细胞1次，但在该细胞中不能产生具有感染能力的病毒颗粒。因此，作为治疗·疫苗用病毒载体具有安全性高的优点。本专利技术的人副流感2型病毒的F蛋白表达Vero细胞，是有用的宿主细胞，其可用于使这样的病毒基因组的F基因缺陷型病毒增殖，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.02.08 JP 2011-0252341.一种制造非增殖型人副流感2型病毒载体的方法，所述方法包括下述各步骤：将F基因缺陷的人副流感2型病毒与Vero...

【专利技术属性】
技术研发人员：福村正之，河野光雄，野阪哲哉，大塚顺平，
申请(专利权)人：国立大学法人三重大学，生物科莫公司，
类型：
国别省市：