一种检测泰乐菌素和替米考星的试纸条及方法技术

本发明专利技术公开了一种检测泰乐菌素和替米考星的试纸条及方法。试纸条包括微孔试剂和试纸，所述微孔试剂中冻干有胶体金标记的泰乐菌素特异性抗体，所述泰乐菌素特异性抗体可为泰乐菌素单克隆抗体或泰乐菌素多克隆抗体；所述试纸由样品吸收垫、反应膜、吸水垫、保护膜、底板依次连接组成，所述反应膜上包括检测区和质控区，检测区包被有替米考星-载体蛋白偶联物，质控区包被有抗抗体。用本发明专利技术试纸条检测泰乐菌素和替米考星的方法简便、快速、直观、准确、便于携带、适用范围广、成本低、易推广使用。

【技术实现步骤摘要】
一种检测泰乐菌素和替米考星的试纸条及方法
本专利技术涉及一种检测泰乐菌素和替米考星的试纸条及方法，具体涉及一种用于检测泰乐菌素和替米考星的胶体金试纸条，其特别适于牛奶中泰乐菌素、替米考星残留的检测。技术背景泰乐菌素和替米考星属于十六元环大环内酯类抗生素，广泛地用作兽药或饲料添加剂，预防和治疗牛、羊、猪、鸡等动物的感染性疾病，还被加入到饲料中用作生长促进剂。但该类药物随动物性食品进入人体后不仅会产生直接的毒性，还会发生过敏反应及产生耐药细菌。为保护食品安全和人类生命健康，很多国家都对该类药物设置了较低的最高残留限量，如欧盟在1999年禁止将泰乐菌素用作饲料添加剂，我国农业部235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》规定牛奶中泰乐菌素和替米考星的最高残留限量为50μg/L。因此迫切需要研究一些高灵敏度、快速的方法对该类药物残留进行检测监控。目前，检测泰乐菌素和替米考星残留的方法主要有微生物法、仪器分析法和免疫化学分析法等。微生物法检测耗时长，缺乏特异性，且所用细菌对不同种类的抗菌药物敏感性存在差异，易导致假阴性和假阳性产生；仪器分析法虽然具有灵敏度高、结果准确、重复性好、假阳性少等优点，但样品前处理过程复杂，仪器化程度高且价格昂贵，分析速度慢，仅适用于样品的确证分析，不适合大批量样品的筛选及现场检测。与之相比，免疫学测定方法灵敏度较高、特异性强、试样预处理简单、分析时间短，适合现场监控和大量样本的筛查。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种检测泰乐菌素和替米考星的试纸条。本专利技术所提供的试纸条包括微孔试剂和试纸，微孔试剂具有微孔塞，试纸包括底板、样品吸收垫、反应膜、吸水垫、保护膜，其依次连接；所述微孔试剂中冻干有泰乐菌素特异性抗体-胶体金标记物；泰乐菌素特异性抗体可为泰乐菌素单克隆抗体或泰乐菌素多克隆抗体；反应膜上包括检测区和质控区；当泰乐菌素特异性抗体为泰乐菌素单克隆抗体时，检测区包被替米考星-载体蛋白偶联物，质控区包被羊抗鼠抗抗体；当泰乐菌素特异性抗体为泰乐菌素多克隆抗体时，检测区包被替米考星-载体蛋白偶联物，质控区包被羊抗兔抗抗体。所述替米考星-载体蛋白偶联物是由替米考星与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白。所述泰乐菌素特异性抗体-胶体金标记物中的泰乐菌素特异性抗体是以泰乐菌素-载体蛋白作为免疫原制备获得。所述样品吸收垫上粘贴有保护膜，为检测端，上面有MAX标记线。所述检测区位于近于有MAX标记的保护膜的一端，所述质控区位于远离有MAX标记的保护膜的一端。所述底板可为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；所述样品吸收垫可为吸滤纸或滤油纸；所述吸水垫为吸水纸；所述反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜；所述保护膜为PE材质保护膜。本专利技术的另一个目的是提供一种制备上述试纸条的方法，其包括步骤：1）制备冻干有泰乐菌素特异性抗体-胶体金标记物的微孔试剂；2）制备具有包被替米考星-载体蛋白偶联物的检测区和包被抗抗体的质控区的反应膜；3）将2）制备好的反应膜与样品吸收垫、吸水垫、保护膜、底板组装成试纸；4）将1）和3）制备好的冻干有泰乐菌素特异性抗体-胶体金标记物的微孔试剂和试纸组装成试纸条。具体地说，步骤包括：1）将泰乐菌素与载体蛋白偶联，制备泰乐菌素-载体蛋白偶联物；将替米考星与载体蛋白偶联，制备替米考星-载体蛋白偶联物；2）用泰乐菌素-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到分泌泰乐菌素单克隆抗体的杂交瘤细胞株或用泰乐菌素-载体蛋白免疫兔，得到泰乐菌素多克隆抗体；3）提取小鼠IgG或兔IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗体或羊抗兔抗抗体；4）分别将替米考星-载体蛋白和抗抗体包被于反应膜的检测区（T）和质控区（C）；5）用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；6）将制备的泰乐菌素特异性抗体加入到制备的胶体金中，得到泰乐菌素特异性抗体-胶体金标记物；7）将泰乐菌素特异性抗体-胶体金标记物冻干在微孔试剂中后，将微孔试剂加上微孔塞；8）将样品吸收垫用含0.5%牛血清白蛋白（体积百分含量）、pH为7.2、0.1mol/L磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃下烘干2h；9）在底板上按顺序粘贴上样品吸收垫、反应膜、吸水垫和保护膜；10）将制备好的微孔试剂和试纸组装成试纸条，2~8℃条件下保存12个月。本专利技术的另一个目的是提供一种应用上述试纸条检测牛奶中泰乐菌素和替米考星残留的方法，它包括步骤：（1）用试纸条进行检测；（2）分析检测结果。本专利技术试纸条的检测原理：将待检牛奶样本滴加于微孔试剂中，混匀后，孵育5min，将标有MAX标记线端向下，插入孵育后的微孔试剂中，待检样品液与微孔中的金标抗体结合后一起向反应膜扩散；若待检样品液中泰乐菌素或替米考星的含量高，则扩散过程中待检样品液中的泰乐菌素或替米考星可与金标抗体相结合，进而完全封闭金标抗体上泰乐菌素的抗原结合点，阻止金标抗体与反应膜上替米考星-载体蛋白偶联物结合，检测区不显色，而抗抗体则可与金标抗体结合，质控区显色；若待检样品液中泰乐菌素或替米考星的含量低或无，则金标抗体上的抗原结合位点不能被封闭，进而金标抗体会与反应膜上替米考星-载体蛋白偶联抗原结合，检测区显色，同时抗抗体也可与金标抗体结合，质控区显色。如果质控区不显色，则试纸失效。如图4所示。阳性：当质控区（C）显示出红色条带，而检测区（T）不显色时，判为阳性。阴性：当质控区（C）显示出红色条带，检测区（T）同时也显示出红色条带，判为阴性。无效：当质控区（C）不显示出红色条带，则无论检测区（T）显示出红色条带与否，该试纸均判为无效。本专利技术的试纸条具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点。其中，采用高特异性的泰乐菌素单克隆抗体，保证了检测结果的可靠性；将金标抗体冻干在微孔试剂中，在检测过程中，能够使金标抗体与待检样品液充分接触，充分反应，从而减少误差，增加整个体系的反应灵敏度。用本专利技术试纸条检测泰乐菌素和替米考星的方法，简便、快速、直观、准确、适用范围广、成本低、易推广使用。附图说明图1为试纸剖面结构示意图。图2为试纸俯视图。图3为微孔试剂图。图4为试纸检测结果判定图。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。实施例1检测泰乐菌素和替米考星的试纸条的构成一、试纸（图1）所述试纸是由底板、样品吸收垫、反应膜、吸水垫、保护膜组成；所述样品吸收垫1、反应膜2、吸水垫3和保护膜7依次按顺序粘贴在底板6上，样品吸收垫的末端与反应膜相连，反应膜的末端与吸水垫相连，样品吸收垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐；所述试纸粘贴有保护膜，保护膜7覆盖在样品吸收垫上，为检测端，上面印有MAX字样（图2）；所述反应膜上有检测区4和质控区5，均呈与所述试纸的长相垂直的条带状，检测区位于近于有MAX标记的保护膜的一端，质控区位于远离有MAX标记的保护膜的一端，检测区包被有替米考星-载体蛋白偶联物（替米考星-卵清蛋白的偶联物），质控区包被有羊抗鼠抗抗体；所述底板为PVC底板；所述样品吸收垫为吸滤纸；所述吸水垫为吸水纸；所述反应膜为硝酸纤维素膜；所述保护膜为PE材质保护本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测泰乐菌素和替米考星的试纸条，其特征在于包括试纸和微孔试剂，所述试纸包括反应膜、样品吸收垫、吸水垫、保护膜、底板，所述反应膜上有检测区和质控区，检测区包被有替米考星?载体蛋白偶联物，质控区包被有抗抗体，所述微孔试剂上冻干有泰乐菌素特异性抗体?胶体金标记物。

【技术特征摘要】
1.一种检测泰乐菌素和替米考星试纸条的制备方法，其包括步骤：1)制备冻干有泰乐菌素单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂；2)制备具有包被替米考星-卵清蛋白偶联物的检测区和包被抗抗体的质控区的反应膜；3)将2)制备好的反应膜与样品吸收垫、吸水垫、保护膜、底板组装成试纸；4)将1)和3)制备好的冻干有泰乐菌素单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂和试纸组装成试纸条；其特征在于：所述泰乐菌素单克隆抗体-胶体金标记物中的泰乐菌素单克隆抗体是以泰乐菌素-牛血清白蛋白偶联物作为免疫原制备获得，所述泰乐菌素-牛血清白蛋白偶联物的合成方法为：取泰乐菌素38mg用5ml水溶解；取牛血清白蛋白100mg用5ml水溶解；将泰乐菌素水溶液加入牛血清白蛋白水溶液中，用磁力搅拌器搅拌反应24h；用0.01mol/LPBS透析3天，每天换液3次，以除去未反应的小分子物质；以12000r/min离心30min，收集上清，分装，于-20℃保存备用；所述替米考星-卵清蛋白偶联物的合成方法为：将22mg替米考星、15mgN,N'-羰基二咪唑用1.5mlN,N-二甲基甲酰胺溶解，室温搅拌反...

【专利技术属性】
技术研发人员：万宇平，吴鹏，罗晓琴，孙震，田甜，崔彦虎，徐念琴，余厚美，付军权，
申请(专利权)人：北京勤邦生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：