通过二价结合剂检测经翻译后修饰的多肽制造技术

本发明专利技术涉及一种二价结合剂，其由结合靶多肽的多肽表位的第一单价结合剂、结合靶多肽上的翻译后多肽修饰的第二单价结合剂和接头组成。进一步公开了借助于这类二价结合剂来检测经翻译后修饰的靶多肽的方法、制备这类二价结合剂的方法和这类二价药剂在组织学染色规程中的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过二价结合剂检测经翻译后修饰的多肽专利技术背景本专利技术涉及一种二价结合剂，其由结合靶多肽的多肽表位的第一单价结合剂、结合靶多肽上的翻译后多肽修饰的第二单价结合剂和接头组成。进一步公开了借助于这类二价结合剂来检测经翻译后修饰的靶多肽的方法、制备这类二价结合剂的方法和这类二价药剂在组织学染色规程中的用途。多肽的一级结构（即其序列）由其编码核酸决定。然而，知晓多肽的一级结构仅是事情的一部分。许多多肽（估计范围为50至90%）经历二级修饰。根据例如二级修饰的类型、经修饰的多肽的百分比和/或例如二级修饰的确切位置/地点，具有同一种一级结构的多肽可以呈现相当不同的生物学功能。二级蛋白质修饰细微调整每种蛋白质的细胞功能。全世界都在继续极其努力了解翻译后修饰和功能变化之间的关系（“翻译后物组学”(posttranslatomics)），这与人类基因组项目不无类似。与分离技术和质谱法组合，蛋白质组学使得有可能剖析并表征翻译后修饰的各部分，并且提供系统性分析。在大约十年前，蛋白质视为氨基酸的线性聚合物，首先变得明显的是，这类多肽链可以用简单的氨基酸修饰进行装饰。然而，最近在许多过程中发现了蛋白质中非常复杂的一种修饰。已经在单一蛋白质中观察到多种化学修饰，并且单独的或各种组合的这些修饰以时间和信号依赖性方式发生。蛋白质的翻译后修饰决定其三级和四级结构，并且调节其活性和功能。“翻译后物组学”的进展已经例如就生物化学途径的调节和牵涉这些蛋白质的疾病状态而言对二级修饰和生物学功能的相互关系产生许多开拓性的了解。然而，经二级修饰的多肽的检测和定量需要尖端的工具和技术。经常将各种类型的分离和任选地片段化技术与质谱法组合以鉴定经翻译后修饰的多肽。经翻译后修饰的多肽的免疫学检测一贯证明是相当困难的。可能遇到各类问题。获得足够纯度和量的所需要的免疫原可能是困难的。依照标准免疫和筛选方法获得的抗体可能不具有需要的特异性和/或亲和力。特别是在需要高度可再现的、一致质量的抗体（例如单克隆抗体）时，获得这类抗体可以证明是非常费力的。这类抗体将必须强烈结合由二级修饰和携带它的多肽部分组成的表位。然而，许多通过常规规程生成的结合剂与其它具有同一种翻译后修饰的多肽显示交叉反应，对识别的表位不展现需要的亲和力和/或对未修饰的多肽显示交叉反应性。许多较大的多肽甚至包含数个发生一类翻译后修饰的位点。可以有例如数个以统计学方式糖基化的苏氨酸残基。评估这类多肽的糖基化状态可能需要对每一个潜在地携带该翻译后修饰的位置具有特异性的数种不同抗体。从各种可能的问题的上述非穷尽讨论及现有技术规程和结合剂看，变得明显的是迫切需要提供可以以实际上无限的数量和不妥协的质量可再现地生成以高亲和力结合经翻译后修饰的多肽的结合剂。令人惊讶地，已经发现了可以通过二价结合剂检测经翻译后修饰的靶多肽，所述二价结合剂由经由接头彼此连接的两个单价结合剂组成，其中第一单价结合剂结合所述靶多肽的多肽表位，第二单价结合剂结合翻译后多肽修饰，其中每个单价结合剂具有范围为5x10-3/秒至10-4/秒的K解离，且其中所述二价结合剂具有3x10-5/秒或更小的K解离。专利技术概述翻译后多肽修饰对于调控和/或调节多肽的特性和/或活性是至关重要的。一种用于检测靶多肽上某类二级修饰的有利方法会依靠特异性结合剂进行。本专利技术涉及结合经翻译后修饰的靶多肽的二价结合剂，其由经由接头彼此连接的两个单价结合剂组成，其中第一单价结合剂结合所述靶多肽的多肽表位，其中第二单价结合剂结合翻译后多肽修饰，其中每个单价结合剂具有范围为5x10-3/秒至10-4/秒的K解离，且其中所述二价结合剂具有3x10-5/秒或更小的K解离。还公开了用于获得特异性结合经翻译后修饰的靶多肽的二价结合剂的方法，所述方法包括以下步骤：选择以介于5x10-3/秒至10-4/秒之间的K解离结合所述靶多肽的未翻译后修饰的表位的第一单价结合剂，选择以5x10-3/秒至10-4/秒的K解离结合翻译后多肽修饰的第二单价结合剂，通过接头偶联这两个单价结合剂，并选择具有3x10-5/秒或更小的K解离值的二价结合剂。还描述并要求保护新颖的二价结合剂的用途，特别是在免疫组织化学规程中的用途。专利技术详述本专利技术涉及结合经翻译后修饰的靶多肽的二价结合剂，该结合剂由经由接头彼此连接的两个单价结合剂组成，其中a)第一单价结合剂结合所述靶多肽的多肽表位，b)第二单价结合剂结合翻译后多肽修饰，c)每个单价结合剂具有范围为5x10-3/秒至10-4/秒的K解离，且d)其中所述二价结合剂具有3x10-5/秒或更小的K解离。依照本专利技术的二价结合剂是正好包含不同特异性的两个单价结合剂的结合剂。在一个实施方案中，通过BiacoreTMSPR技术表征每个单价结合剂的和二价结合剂的动力学速率特性，如实施例中详细描述的。如熟练技术人员会领会的，可以根据期望分离并纯化本专利技术中描述的二价结合剂。在一个实施方案中，本专利技术涉及分离的如本文中公开的二价结合剂。“分离的”二价结合剂是已经得到鉴定，并且与/从例如用于合成这类二价结合剂的试剂混合物分开和/或回收的二价结合剂。这类反应混合物的不想要的组分是例如没有在期望的二价结合剂中用尽的单价结合剂。在一个实施方案中，将所述二价结合剂纯化至大于80%。在一些实施方案中，将所述二价结合剂分别纯化至按重量计大于90%、95%、98%或99%。在两个单价结合剂都是多肽的情况下，例如容易在蛋白质检测中使用例如考马斯蓝或银染色剂通过还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE测定纯度。在核酸水平上评估纯度的情况下，应用大小排阻层析来将二价结合剂与副产物分开，并监测260nm处的OD以评估其纯度。冠词“一个”和“一种”在本文中用于指一个/种或超过一个/种（即至少一个/种）该冠词的语法对象。举例而言，“一个/种抗体”指一种抗体或超过一个/种抗体。如本文中使用的，术语“寡核苷酸”或“核酸序列”一般指短的、通常单链的多核苷酸，其包含至少8个核苷酸且至多约1000个核苷酸。在一个优选的实施方案中，寡核苷酸会具有至少9、10、11、12、15、18、21、24、27或30个核苷酸的长度。在一个优选的实施方案中，寡核苷酸会具有不超过200、150、100、90、80、70、60、50、45、40、35或30个核苷酸的长度。下文对多核苷酸给出的描述同等且完全适用于寡核苷酸。术语寡核苷酸应当广义理解，且包括DNA和RNA以及其类似物和修饰。例如，寡核苷酸可以含有在标准碱基脱氧腺苷(dA)、脱氧鸟苷(dG)、脱氧胞苷(dC)、脱氧胸苷(dT)、脱氧尿苷(dU)处携带取代基的经取代的核苷酸。这类经取代的核碱基的例子为：5-取代的嘧啶如5甲基dC、氨基烯丙基(aminoallyl)dU或dC、5-(氨乙基-3-丙烯酰亚氨(acrylimido))-dU、5-丙炔基-dU或-dC、5卤化的-dU或-dC；N取代的嘧啶如N4-乙基-dC；N取代的嘌呤如N6-乙基-dA、N2-乙基-dG；8取代的嘌呤如8-[6-氨基)-己-1-基]-8-氨基-dG或-dA、8卤化的dA或dG、8-烃基dG或dA；和2取代的dA如2氨基dA。寡核苷酸可以含有核苷酸或核苷类似物。即，可以通过使用核碱基类似物来交换天然存在的核碱本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.12.23 EP 101966877;2011.07.13 EP 1117383241.一种能够结合经翻译后磷酸化的靶多肽的式I的分离的二价结合剂，A-a’:a-S-b:b’-B(式I)所述二价结合剂由经由接头彼此连接的不同特异性的两个单价结合剂A和B组成，其中：a)-代表共价键，b)a-S-b是具有介于10nm和50nm之间的长度的接头，其中S是间隔物，c)a’:a和b:b’是由各自经由多碱基配对形成稳定双链体的杂交核酸序列组成的结合对，其中结合对a’:a中的序列分别不结合结合对b:b’的序列，反之亦然，d)第一单价结合剂A是在单个结合位点处与靶多肽相互作用的分子，其中所述第一单价结合剂结合所述靶多肽的多肽表位，且其中所述多肽表位未进行翻译后修饰，e)第二单价结合剂B结合翻译...

【专利技术属性】
技术研发人员：M杰尔格，D海因德尔，C克莱恩，A莫滕斯，V施密德，M施莱姆尔，M索库波娃，M塔克，
申请(专利权)人：霍夫曼拉罗奇有限公司，
类型：
国别省市：