一种重组人凝血因子Ⅻa的生产方法技术

技术编号:9293149 阅读:204 留言:0更新日期:2013-10-30 22:45
本发明专利技术属于基因工程领域,特别涉及一种重组人凝血因子Ⅻa的生产方法。本发明专利技术通过基因合成的方法得到编码人凝血因子Ⅻa活性区域的DNA,通过毕赤酵母进行扩增,将酵母培养液离心透析、滤膜压滤,再通过以Ni-NTA为介质的柱层析纯化得到重组人凝血因子Ⅻa。本发明专利技术降低了人凝血因子Ⅻa的生产成本,产品活性高于从血液中提取的凝血因子Ⅻa。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种重组人凝血因子Ⅻa的生产方法,步骤如下:(1)通过基因合成的方法得到编码人凝血因子Ⅻa活性区域的DNA,将得到的DNA克隆到pPICZαB载体中,构建pPICZαB?凝血因子Ⅻa载体,转化大肠杆菌DH5α;所述活性区域指人凝血因子Ⅻa氨基酸片段354?615;(2)利用质粒抽提方法抽提重组质粒pPICZαB?凝血因子Ⅻa;将重组质粒pPICZαB?凝血因子Ⅻa进行SacⅠ单酶切线性化,并回收后待用;(3)接种毕赤酵母X33或GS115,将培养物转移至YPD液体培养基中,在27?30℃,200?250rpm的条件下培养至OD600=1.3~1.5,4℃离心,依次用冰无菌水及冰的1M山梨糖醇洗涤重悬沉淀;(4)取上述菌液,与线性化DNA混匀,点击转化后加入预冷过的1M的山梨糖醇,转移至无菌微量离心管;离心后取20?200μL菌液涂布至YPDSZ平板,30℃孵育72~96h,直至菌落出现,点种保存;筛选高拷贝阳性克隆菌株进行培养,培养结束后离心收集上清液;(5)将步骤(4)中收集得到的上清液经透析、0.45μm的滤膜压滤,再通过以Ni?NTA为介质的柱层析纯化,得到重组人凝血因子Ⅻa。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员:钱冬明胡亮李立炯
申请(专利权)人:维亚生物科技上海有限公司
类型:发明
国别省市:

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