丙氨酸或消耗丙氨酸所产生的化合物的好氧生产方法技术

本发明专利技术涉及通过下述方法解决的作为本发明专利技术基础的问题：在第一方面，一种用于生产丙氨酸或消耗丙氨酸所产生的化合物的方法，所述方法包括：（a）提供表达重组丙氨酸脱氢酶或其变体的细胞，（b）在有无机氮源存在下，在好氧条件下，在水相中培养所述细胞，和（c）使所述细胞与有机相接触，其中所述细胞是原核细胞或低等真核细胞。

【技术实现步骤摘要】
丙氨酸或消耗丙氨酸所产生的化合物的好氧生产方法
本专利技术涉及一种用于生产丙氨酸或消耗丙氨酸所产生的化合物的方法，所述方法包括：（a）提供表达重组丙氨酸脱氢酶或其变体的细胞，（b）在有无机氮源存在下，在好氧条件下，在水相中培养所述细胞，和（c）使所述细胞与有机相接触，其中所述细胞是原核细胞或低等真核细胞。
技术介绍
除了用作蛋白形成氨基酸,即作为大量蛋白质的必需组分的氨基酸以外，丙氨酸还被用作在生物技术工艺和化学合成中广泛使用的胺供体。就工业生物技术合成而言，可以以化学合成的丙氨酸的形式或以酵母浸出物的形式，将需要的丙氨酸加给具有生物合成活性的细胞。但是，考虑到成本方面和可能要从培养基中纯化的产物的纯度，更有利的是，具有生物合成活性的细胞本身会足量地生产需要的丙氨酸。因此，对可以用于生物技术中的微生物存在极大的兴趣：所述微生物连续地生产尽可能多的量的丙氨酸，所述丙氨酸然后可用于在细胞内部或外部的后续合成步骤。现有技术教导，当在厌氧条件下维持表达丙氨酸脱氢酶的细胞时，形成特别大量的丙氨酸（“ProductionofL-alaninebymetabolicallyengineeredEscherichiacoli”ApplMicrobiolBiotechnol(2007),77:355-366）。但是，这样的条件会造成显著减少的细胞生长、降低的代谢性能和昂贵底物（诸如葡萄糖）的代谢，形成初级代谢的不希望的副产物，从而损害整个工艺的效率和产物收率。因此，如果要在工业规模开发经济的生物技术工艺，必须在好氧条件下实现这些工艺。在该背景下，需要适合用于在好氧条件下增加在生物技术上的有关细胞中可提供用于合成的丙氨酸的量的方法。此外，需要用于经生物技术生产ω-氨基羧酸的方法，所述方法具有减少的丙氨酸添加，或者尽可能仅任选地添加丙氨酸或仅暂时需要添加丙氨酸，其中生产ω-氨基羧酸所需的氮以无机氮盐的形式提供，和/或需要其中以不添加丙氨酸的反应模式提高ω-氨基羧酸收率的方法。
技术实现思路
这些和其它目的由本申请的主题实现，且具体地，也由所附独立权利要求的主题实现，其中实施方案源自从属权利要求。在第一方面，下述方法解决了作为本专利技术的基础的问题：一种用于生产丙氨酸或消耗丙氨酸所产生的化合物的方法，所述方法包括：a)提供表达重组丙氨酸脱氢酶或其变体的细胞，b)在有无机氮源存在下，在好氧条件下，在水相中培养所述细胞，和c)使所述细胞与有机相接触，其中所述细胞是原核细胞或低等真核细胞。在第一方面的第一个实施方案中，一种方法解决了所述问题，其中所述细胞包括：一种核酸，所述核酸包含编码alkL多肽,优选恶臭假单胞菌（Pseudomonasputida）AlkL（数据库代码AJ245436）或其变体的序列和/或所述alkL多肽或其变体。在第二个实施方案（其也是第一个实施方案的一个实施方案）中，一种方法解决了所述问题，其中所述alkL多肽或其变体是异源的，且优选地过表达。在第三个实施方案（其也是第一个至第二个实施方案的一个实施方案）中，一种方法解决了所述问题，其中通过在有机相存在下进行步骤b），实现步骤c）。在第四个实施方案（其也是第一个至第三个实施方案的一个实施方案）中，一种方法解决了所述问题，其中所述有机相包含疏水脂肪酸酯，优选月桂酸甲酯。在第五个实施方案（其也是第四个实施方案的一个实施方案）中，一种方法解决了所述问题，其中所述有机相除了包含疏水脂肪酸酯以外还包含疏水脂肪酸。在第六个实施方案（其也是第一个至第五个实施方案的一个实施方案）中，一种方法解决了所述问题，其中所述有机相包含至少一种选自下述的疏水溶剂：未被取代的、被取代的、支链的和非支链链的烷烃、环烷烃、含芳基化合物、含杂芳基化合物、二烷基醚、脂肪醇、甘油三酯和卤代烃。在第七个实施方案（其也是第六个实施方案的一个实施方案）中，一种方法解决了所述问题，其中所述疏水脂肪酸是不饱和脂肪酸，优选油酸。在第八个实施方案（其也是第一个至第七个实施方案的一个实施方案）中，一种方法解决了所述问题，其中所述细胞包括异源转氨酶，所述转氨酶识别丙氨酸作为底物，且所述转氨酶优选地选自：得自青紫色素杆菌（Chromobacteriumviolaceum）ATCC12472的ω-转氨酶（数据库代码NP_901695）及其变体。在第九个实施方案（其也是第一个至第八个实施方案的一个实施方案）中，一种方法解决了所述问题，其中所述细胞除了包括异源转氨酶以外，还包括一种或超过一种单加氧酶，所述单加氧酶单独地或依次地催化脂肪酸或脂肪酸酯的氧化，以生成ω-氧代-脂肪酸或ω-氧代-脂肪酸酯。在第十个实施方案（其也是第一个至第九个实施方案的一个实施方案）中，一种方法解决了所述问题，其中所述一种或超过一种单加氧酶是异源的，且优选地选自：来自AlkB家族的单加氧酶和来自CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶及其变体。在第十一个实施方案（其也是第一个至第十个实施方案的一个实施方案）中，一种方法解决了所述问题，其中所述细胞是细菌细胞，优选大肠杆菌。在第十二个实施方案（其也是第一个至第十一个实施方案的一个实施方案）中，一种方法解决了所述问题，其中步骤c）进行至少60分钟。在第十三个实施方案（其也是第一个至第十二个实施方案的一个实施方案）中，一种方法解决了所述问题，其中所述水相包含小于10mM、优选地小于5mM、更优选地甚至小于1mM丙氨酸。在第十四个实施方案（其也是第一个至第十三个实施方案的一个实施方案）中，一种方法解决了所述问题，其中所述有机相占水相和有机相的总体积的至少5体积%，优选地超过20体积%。在第二方面，如下解决了作为本专利技术的基础的问题：在有机相存在下在好氧条件下使用表达异源丙氨酸脱氢酶或其变体的细胞来生产丙氨酸或消耗丙氨酸所产生的化合物，其中所述细胞是原核细胞或低等真核细胞，且其中所述有机相优选地包含疏水脂肪酸酯和疏水脂肪酸，甚至更优选月桂酸甲酯和油酸。在第三方面，如下解决了作为本专利技术的基础的问题：使用有机相来增加丙氨酸或消耗丙氨酸所产生的化合物的收率，其中包括，使生产丙氨酸或消耗丙氨酸所产生的化合物的原核细胞或低等真核细胞与所述有机相接触，其中所述有机相优选地包含疏水脂肪酸酯和疏水脂肪酸，甚至更优选月桂酸甲酯和油酸。在第一、第二或第三方面的另一个实施方案中，一种方法或用途解决了所述问题，其中所述细胞以至少0.5、更优选至少1、甚至更优选至少5、最优选至少10的光密度存在于水溶液中。在第一、第二或第三方面的另一个实施方案中，一种方法或用途解决了所述问题，其中所述丙氨酸脱氢酶是得自枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）的丙氨酸脱氢酶（数据库代码NP_391071）或其变体。专利技术人已经发现，当使表达丙氨酸-脱氢酶的原核宿主细胞与有机溶液接触时，会令人惊奇地显著增加所述细胞在好氧条件下和在有无机氮源存在下的丙氨酸生产量。本专利技术的教导可以用于改善所有这样的生物技术工艺：其包括消耗丙氨酸来生产产物诸如精细化学品，并且当使用代谢活性细胞时，其包括在水性培养基中培养所述细胞和对产物进行后处理。在一个优选的实施方案中，在本文中使用的表述“细胞”应当理解为是指，具有代谢活性的活细胞，优选全细胞催化剂，其表达或甚至更优本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于生产丙氨酸或消耗丙氨酸所产生的化合物的方法，所述方法包括：a)?提供表达重组丙氨酸脱氢酶或其变体的细胞，b)?在有无机氮源存在下，在好氧条件下，在水相中培养所述细胞，和c)?使所述细胞与有机相接触，其中所述细胞是原核细胞或低等真核细胞。

【技术特征摘要】
2012.04.02 EP 12162846.51.用于生产丙氨酸或消耗丙氨酸所产生的化合物的方法，所述方法包括：a)提供表达重组丙氨酸脱氢酶的细胞，b)在有无机氮源存在下，在好氧条件下，在水相中培养所述细胞，和c)使所述细胞与有机相接触，其中所述细胞是原核细胞或低等真核细胞，和其中所述有机相包含疏水脂肪酸和疏水脂肪酸酯。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞包括：一种核酸，所述核酸包含编码alkL多肽的序列，和/或所述alkL多肽。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述alkL多肽是异源的。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述有机相包含至少一种选自下述的疏水溶剂：未被取代的、被取代的、支链的和非支链的烷烃、环烷烃、含芳基化合物、含杂芳基化合物、二烷基醚、脂肪醇、甘油三酯和卤代烃。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述疏水脂肪酸是不饱和脂肪酸。6.根据权利要求1-3中之一所述的方法，其中所述细胞包括异源转氨酶，所述转氨酶识别丙氨酸作为底物，且所述转氨酶选自：得自青紫色素杆菌ATCC12472的ω-转氨酶。7.根据权利要求4所述的方法，其中所述细胞除了包括异源转氨酶以外，还包括一种或超过一种单加氧酶，所述单加氧酶单独地或依次地催化脂肪酸或脂肪酸酯的氧化，以生成ω-氧代-脂肪酸或ω-氧代-脂肪酸酯。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述一种或超过一种单加氧酶是异源的，且选自：来自AlkB家族的单加氧酶和来自CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶。9.根据权利要求1-3中之一所述的方法，其中所述细胞是细菌细胞。10.根据权利要求1-3中之一所述的方法，其中步骤c)进行至少60分钟。11.根据权利要求1-3中之一所述的方法，其中所述水相包含小于10mM的丙氨酸。12.根据权利要求1-3中之一所述的方法，其中所述有机相占水相和有机相的总体积的至少5体积％。13.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞包括：一种核酸，所述核酸包含恶臭假单胞菌AlkL。14.根据权利要求2所述的方法，其中所述alkL多肽过表达。15.根据权利要求1-3中之一所述的方法，其中所述有...

【专利技术属性】
技术研发人员：HG亨内曼，S沙费尔，M韦泽尔，M珀特，JC普费弗，T哈斯，J吉伦，EM埃克尔，S雷德，W克劳蒂尔，A斯克拉，
申请(专利权)人：赢创德固赛有限公司，
类型：发明
国别省市：