一种转基因定位整合的方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种转基因定位整合的方法及其应用。具体地，本发明专利技术提供了一种变异的loxP元件。将野生型的loxp位点中反向重复序列的“ATAAC”序列突变为“CACCT”，即为变异的loxP元件。所述变异的loxP元件能够极大提高cre-loxp系统的整合特异性和整合效率。据此可以实现高效率的基因定点整合。

【技术实现步骤摘要】
一种转基因定位整合的方法及其应用
本专利技术属于生物
，具体地，本专利技术涉及一种转基因定位整合的方法及其应用。
技术介绍
制备转基因动物的方法在基础研究和应用研究中有着非常重要的作用。目前科学家们已经开展了多种转基因技术，以提高转基因动物的靶向性和的整合效率。但目前在大动物中，转基因的整合效率和表达率均不甚理想。当前国际通用的转基因方法是显微注射法，该法成本较高，成功率很低，就转基因动物—乳腺生物反应器而言，其成功率仅3％左右。显微注射导致外源基因在染色体上随机整合，且转基因的表达极大地受周围宿主基因组的影响。外源基因的随机整合可能导致下述问题：1.转基因整合入非活跃染色体序列中的机率较活跃染色体区域高，受整合位点影响，大多数转基因的表达低下或不表达；2.转基因整合入高频重组位点时，会发生遗传不稳定；3.随机外源基因整合常引起内源基因突变或表达改变，影响转基因动物的正常发育和健康；4.多位点整合的转基因动物，在后代中因整合位点分离导致转基因表达性状改变和育种困难；5.整合拷贝数过高或过低易导致转基因表达低下或不表达。以上问题是研究基因功能、创建动物疾病模型、开发有商业价值模型和创制转基因育种新材料的关键障碍。开发转基因的定位整合方法有可能解除传统技术造成的费用高昂，效率低下的负面效应，促进转基因家畜的产业化发展。但是目前还没有控制目的基因在基因组特定位置高效整合的方法，因此本领域迫切需要开发一种高效的转基因定位整合的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供一种转基因定位整合的方法及其应用。在本专利技术的第一方面，提供了一种变异的loxP元件，所述变异的loxP元件具有SEQIDNO.：30所示的序列。在本专利技术的第二方面，提供了一种构建物，所述的构建物从5’到3’依次含有以下元件：(a)本专利技术第一方面所述变异的loxP元件；(b)外源基因表达盒和/或筛选标记表达盒；(c)具有SEQIDNO.：28所示序列的野生型loxP元件；其中，元件(a)和元件(c)可以互换。在另一优选例中，所述的筛选标记因为新霉素基因、或嘌呤霉素抗性基因。在另一优选例中，所述的外源基因选自下组：溶菌酶基因、鲑鱼降钙素基因、或血清白蛋白基因。在另一优选例中，元件(a)和元件(c)为同向排列。在另一优选例中，所述的元件(a)和元件(c)为异向排列。在本专利技术的第三方面，提供了一种载体，所述载体含有本专利技术第二方面所述的构建物。在本专利技术的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有本专利技术第二方面所述的构建物，或其染色体整合有一个或多个本专利技术第二方面所述的构建物。在另一优选例中，所述的宿主细胞为人或非人哺乳动物的细胞。在另一优选例中，所述的非人哺乳动物选自：山羊、绵羊、猪、牛、狗和兔，较佳地为山羊。在另一优选例中，所述的宿主细胞为山羊成体体细胞、或山羊胎儿体细胞、或山羊胚胎干细胞。在另一优选例中，所述的宿主细胞是用选自下组的方法将本专利技术第二方面所述的构建物导入细胞的：同源重组法、显微注射法、电穿孔法、脂质体转染法、磷酸钙沉淀法、病毒感染法、或精子载体法。在本专利技术的第五方面，提供了一种制备转基因动物的方法，包括步骤：(i)在Cre重组酶存在的条件下，用本专利技术的第三方面所述的载体转化第四方面所述的细胞；和(ii)将转化的细胞再生为动物体，从而获得转基因动物。在另一优选例中，步骤(i)包括步骤：(i-1)Cre酶表达载体与本专利技术的第三方面所述的载体共转化第四方面所述的细胞；或(i-2)在具有细胞穿透活性的TAT-Cre重组蛋白的作用下，用本专利技术的第三方面所述的载体对第四方面所述的细胞的染色体进行基因整合。应理解，在本专利技术范围内中，本专利技术的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明下列附图用于说明本专利技术的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本专利技术范围。图1显示了对山羊胎儿成纤维细胞的性别鉴定结果，M为DL2000分子量标准，条带自下而上分别为100、250、500、750、1000、2000bp；N5、N4-A、N37-A和N37-B均为分离的胎儿；-为阴性羊对照；+为阳性羊对照；水为PCR体系对照。图2显示了对山羊胎儿成纤维细胞的转基因整合鉴定结果，M为DL2000分子量标准，条带自下而上分别为100、250、500、750、1000、2000bp；N5、N4-A、N37-A和N37-B均为分离的胎儿；-为阴性羊对照；+为阳性羊对照；水为PCR体系对照。图3显示了TAT-Cre重组蛋白的鉴定结果，M为marker，SF为TAT-Cre菌体超声破碎后的上清，FT为SP-sepharoseTM柱子的流穿液，E1为SPsepharoseTM柱子的洗脱液，E2为source15s柱子的洗脱液。图4为鲑鱼降钙素定位整合质粒pTM-sCT2的构建流程示意图。图5显示了人工合成的双loxp基因序列。图6显示了pBLG-sct质粒的构建示意图。图7显示了全人工合成的鲑鱼降钙素序列。图8显示puro表达框架扩增电泳图，其中，M为D2000marker；1、2为puro表达框架扩增电泳图。图9显示了PCR法鉴定质粒pMD-Puro；M为D2000marker；11-20为转化挑取克隆；11、12、13、14、16、17、18、19、20为阳性克隆；21为阴性对照。图10显示了用NotI酶切鉴定质粒pMD-Puro电泳图；M：1kbmarker；11-20为转化挑取克隆；其中16、17、18、19、20为阳性克隆。图11显示了pTM-sCT2的PCR鉴定图谱；其中，M为D2000marker；1-23为挑取单克隆：2、19、20为阳性克隆；24为阴性对照。图12显示了用NotI酶切鉴定质粒pTM-sCT2电泳图；M为D2000marker；2、19、20为阳性克隆。图13显示了pTM-sCT2的酶切鉴定图谱；其中1为DL5000的DNA分子量Marker，2为NotⅠ酶切质粒pTM-sCT2的电泳图谱。图14显示了筛选克隆5’端检测电泳图；M为D2000，66-69、71、73-85、93均为筛选克隆5’端检测电泳图，67、73、74、78、81、85为阳性，0为阴性对照图15显示了筛选克隆3’端检测电泳图；M为1kbDNAMarker，20、23、24、34、41、47、50为筛选克隆3’端检测电泳图，0为阴性对照。图16显示了鲑鱼降钙素功能基因检测电泳图；M为D2000，10、14、20、23、24、34、41、47、54、59、67、73、74、79、81、85、89为功能基因neo检测电泳图，1为阳性对照，2为阴性对照。图17显示了筛选基因neo检测电泳图；M为D2000，20、23、24、34、41、47、54、59、67、73、74、79、81、85为筛选克隆标记基因neo检测电泳图，79为neo基因阳性，1为阳性对照，2为阴性对照。图18显示了pBS185基因检测电泳图；M为D2000；23、24、34、47、59、74、78、81、85为筛选克隆pBS185基因检测电泳图，其中24、34、81为该基因阳性；0为阴性对照。图19显示了鲑本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种变异的loxP元件，其特征在于，所述变异的loxP元件具有SEQ?ID?NO.：30所示的序列。

【技术特征摘要】
1.一种变异的loxP元件，其特征在于，所述变异的loxP元件的序列如下所示：ataacttcgtataatgtatgctatacgaaaggtg。2.一种构建物，其特征在于，所述的构建物从5’到3’依次含有以下三个元件：(a)权利要求1所述的变异的loxP元件；(b)外源基因表达盒和/或筛选标记表达盒；(c)如SEQIDNO.:28所示序列的野生型loxP元件；或(c)如SEQIDNO.:28所示序列的野生型loxP元件；(b)外源基因表达盒和/或筛选标记表达盒；(a)权利要求1所述的变异的loxP元件。3.如权利要求2所述的构建物，其特征在于，所述的筛选标记为新霉素基因、或嘌呤霉素抗性基因。4.如权利要求2所述的构建物，其特征在于，所述的外源基因选自下组：溶菌酶基因、鲑鱼降钙素基因、或血清白蛋白基因。5.如权利要求2所述的构建物，其特征在于，元件(a)和元件(c)为同向排列。6.如权利要求2所述的构建物，其特征在于，所述的元件(a)和元件(c)为异向排列。7.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求2所述的构建物。8.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求2所述的构建物，或其染色体整合有一个或多个权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：成国祥，刘思国，陈建泉，徐旭俊，刘国辉，
申请(专利权)人：上海杰隆生物工程股份有限公司，上海转基因研究中心，
类型：发明
国别省市：