一种制备育性减低植物的方法技术

本发明专利技术公开了一种RNA干扰载体以及将其导入目的植物所得到的转基因植物，所述转基因植物为不育转基因植物或育性减低的转基因植物。本发明专利技术还公开了一种将目的植物培育为不育突变体或育性降低突变体的方法，该方法包括了通过叠氮化钠诱变目的植物种子的步骤。本发明专利技术公开了通过RNA干扰或TILLING(Targeting?Induced?Loca1?Lesions?IN?Genomes)技术筛选来制备育性减低植物或不育系的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】一种制备育性减低植物的方法
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种制备育性减低植物的方法。
技术介绍
植物雄性不育是一个与农业生产密切相关的植物学性状，是植物在发育过程中基因型表达与环境相互作用的结果。植株本身的雄性不育就可以在免去人工去雄的情况下作为遗传工具用于开发利用作物杂种优势，进行轮回选择，回交等育种研究。利用植物的雄性不育性培育各种雄性不育系，再借助遗传工程大量生产杂交种子，从而使许多作物特别是自花传粉作物的杂种优势得以在生产上利用，为大规模生产杂交种子提供了可能性。水稻是我国重要的粮食作物，水稻杂种优势和杂交育种方式的发现与常规育种相比增产20％以上，给水稻生产带来了巨大的贡献，在发现环境敏感的核不育水稻材料后，袁隆平院士又提出了两系选育法，使得水稻杂交育种策略更加简便，各方面的品质也得到了提高，产量又能提高5-10％。农垦58S是最早发现的光周期调节育型的雄性不育材料，它和它转育的粳稻和籼稻光敏不育系在一定温度范围可被长日照诱导不育，短日照诱导可育。由于同时又受到温度的影响，它们又被称为光温敏不育系。人们通过基因定位发现一个非编码的前体RNA调节了光温敏不育。但夏季异常低温(＜23度)会使得制种失败，因此光温敏不育材料的应用受到了一定的影响。植物生长发育除了收到光照和温度的影响外，湿度也是一个重要的环境因素，虽然湿度和水稻雄性不育的关系国内外都没有任何报道。但早在1993年拟南芥的研究中人们早就发现一类湿度相关的雄性不育的突变体pop1，它是由于突变体花粉表面含油层(tryphine)缺少长链脂肪酸和蜡质而使得花粉不能从柱头上吸水，从而导致授粉失败和不育(但突变体从相对环境湿度70％的环境移入相对湿度为90％的高湿箱，育性得到了恢复Preussetal.，GeneDev.19937：947-985)。专利技术公开本专利技术的一个目的是提供一种RNA干扰载体。本专利技术提供的RNA干扰载体，为将序列表中的序列1所示的DNA分子插入pH7GWIWG2(II)中得到的载体。上述RNA干扰载体为将序列表中的序列1所示的DNA分子通过同源重组插入pH7GWIWG2(II)中得到的载体；具体为将序列表中的序列1所示的DNA分子通过同源重组正向插入和反向插入pH7GWIWG2(II)中得到的载体。上述RNA干扰载体按照如下方法制备：1)将序列表中序列1所示的DNA分子与pDONR221载体进行BP反应，得到中间载体；2)将所述中间载体与pH7GWIWG2(II)载体进行LR反应，得到RNA干扰载体。上述序列表中序列1所示的DNA分子具体通过如下方法制备：以水稻的cDNA为模板，用引物对A进行PCR扩增，得到PCR产物即为序列表中序列1所示的DNA分子。所述引物对A由序列表中序列3所示的单链DNA和序列4组成的单链DNA组成。含有上述的RNA干扰载体的重组菌或转基因细胞系也是本专利技术保护的范围。上述的RNA干扰载体、上述的重组菌或转基因细胞系在培育水稻不育系或降低水稻育性的应用也是本专利技术保护的范围。本专利技术的第二个目的是提供一种培育转基因植物的方法。本专利技术提供的方法，为将上述的RNA干扰载体导入目的植物，得到转基因植物；所述转基因植物为如下1)或2)：1)不育转基因植物或2)所述转基因植物的育性低于所述目的植物；所述目的植物具体为单子叶植物；所述单子叶植物进一步具体为水稻。由上述的方法得到的转基因植物也是本专利技术保护的范围；所述转基因植物为不育转基因植物或育性减低的转基因植物；所述植物具体为单子叶植物；所述单子叶植物进一步具体为水稻。上述育性减低的转基因植物为转基因植物的育性低于目的植物的转基因植物。本专利技术的第三个目的是提供一种将目的植物培育为不育突变体或育性降低突变体的方法。本专利技术提供的方法，包括如下步骤：1)诱变目的植物种子和设计用于特异扩增目的植物中的三萜合酶编码基因的引物对B及标记荧光标记物的引物对B；所述诱变目的植物种子为用叠氮化钠诱变多粒目的植物种子，得到诱变种子；所述设计用于特异扩增目的植物中的三萜合酶编码基因的引物对B为根据所述目的植物中的三萜合酶编码基因设计用于特异扩增的引物对B，所述标记荧光标记物的引物对B中的每条引物标记不同荧光标记物，所述不同荧光标记物的波长不同；2)将所述诱变种子培养，得到第一代突变M1代群体；将所述第一代突变M1代群体自交，得到第二代突变M2代群体；3)提取第二代突变M2代群体中单株的基因组DNA；将n个M2代单株的基因组DNA混合得到一个DNA池；n为2-8；4)以每个所述DNA池为模板，用所述引物对B和所述标记荧光标记物的引物对B共同作为引物进行扩增，得到PCR产物；5)将所述PCR产物经核酸内切酶CELI酶切，得到DNA池对应酶切产物；6)电泳检测每一个所述DNA池对应酶切产物，若所述DNA池对应酶切产物在不同荧光标记物对应的波长下均产生亮点，则所述DNA池对应的n个M2代单株中有或候选有育性降低突变体或者不育突变体；若所述DNA池对应酶切产物在不同荧光标记物对应的波长下没有均产生亮点，则所述DNA池对应的n个M2代单株中没有或候选没有育性降低突变体或者不育突变体；所述育性降低突变体为育性低于所述目的植物的植株。上述方法中，在所述步骤6)后还包括如下步骤：将有或候选有育性降低突变体或者不育突变体的n个M2代M2代单株的基因组DNA分别与所述目的植物的基因组DNA混合作为模板，重复步骤4)-5)，得到M2代单株对应的酶切产物；电泳检测每一个所述M2代单株M2代单株对应的酶切产物，若所述M2代单株对应的酶切产物在不同荧光标记物对应波长下均产生亮点，则所述M2代单株为或候选为不育突变体或育性降低突变体；若所述M2代单株对应的酶切产物在不同荧光标记物对应波长下没有均产生亮点，则所述M2代单株不为或候选不为不育突变体或育性降低突变体。上述方法中，步骤1)中，所述叠氮化钠诱变多粒目的植物种子为将所述多粒目的植物种子浸泡在浓度为2mM的叠氮化钠水溶液中6h；室温浸泡即可。所述三萜合酶的氨基酸序列为序列表中的序列2；所述不同荧光标记物为波长为682nm的荧光标记物DY-682和波长为782nm的荧光标记物DY-782；所述三萜合酶编码基因的核苷酸序列具体为序列表中的序列5；所述引物对B为如下1)-3)中的任意一种：1)由序列表中序列6所示的单链DNA分子和序列表中序列7所示的单链DNA分子组成；2)由序列表中序列8所示的单链DNA分子和序列表中序列9所示的单链DNA分子组成；3)由序列表中序列10所示的单链DNA分子和序列表中序列11所示的单链DNA分子组成；所述目的植物为单子叶植物；所述单子叶植物为单子叶禾本科植物；所述单子叶禾本科植物具体为水稻。上述育性降低突变体为育性低于目的植物的突变体，在具体实施例中，目的植物具体为水稻，育性降低突变体具体为育性低于水稻的突变体。由上述的方法制备的不育突变体或育性降低突变体也是本专利技术保护的范围。上述育性降低突变体，其保藏号为CGMCCNO.6150。上述的转基因植物或上述的不育突变体或育性降低突变体在杂交制种中的应用也是本专利技术保护的范围。上述育性降低突变体为育性低于目的植物的突变体，所述目的植物为单子叶植物；所述单子叶植物为单子叶本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.12.08 CN 201110406266.21.一种恢复或提高水稻育性的方法，包括如下步骤：在水稻的开花期，保持植物花序生长湿度为80-100%；其中所述水稻为不育突变体或育性降低突变体，其中所述不育突变体或育性降低突变体通过沉默或失活水稻中的编码三萜合酶的基因而获得，且其中所述失活通过突变编码三萜合酶的基因而实现，且其中所述编码三萜合酶的基因是SEQID.No:5；其中所述失活水稻中的编码三萜合酶的基因为如下1)-3)中至少一种的点突变：1)...

【专利技术属性】
技术研发人员：漆小泉，薛哲勇，张英春，徐霞，刘丹，
申请(专利权)人：中国科学院植物研究所，
类型：
国别省市：