抗GD2抗体制造技术

本申请描述嵌合的、人源化的、亲和力成熟的、稳定性提高的、以及双特异性的抗GD2抗体及其片段。还提供了使用各种抗体或其组合物检测、预防、和/或治疗性处理GD2相关疾病，尤其是神经母细胞瘤的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】抗GD2抗体介绍单克隆抗体(MoAb)疗法是一种公认的癌症治疗模态，有5种MoAb已经被FDA批准用于成人实体瘤，包括结肠直肠癌和乳腺癌，非小细胞肺癌，鳞状细胞癌和黑素瘤(Boyiadzisetal.,2008,ExpertOpinBiolTher8,1151-8;Yanetal.,2008,CancerJ14,178-83)。然而这种模态在儿科癌症方面的应用尚且不足。与化疗或放射不同，MoAb治疗不具有骨髓抑制性和遗传毒性，一般很少有长期毒性。这些对于幼儿来说是关键性的考虑因素。更重要的是，MoAb对在高风险神经母细胞瘤(NB)中通常出现的血液、骨髓和骨中的转移癌症有效。作为一类药物，人源或人源化IgG1抗体已经得到了广泛的研究。此外，抗体可携带细胞毒性负荷物(基于免疫、放射性同位素、毒素或酶的)，从而增加靶向性治疗的选项。神经母细胞瘤(Neuroblastoma,NB)是最常见的儿童颅外实体肿瘤。在大约50%的病例中，根治性策略必须解决软组织团块和骨髓(BM)中转移的问题。剂量密集的化疗提高肿瘤的可切除性，且手术后放射可降低原发部位的复发风险至<10%(Kushneretal.,2001,JClinOncol19,2821-8)。然而，骨髓疾病，如组织学和间碘苯甲胍(MIBG)扫描所证实的，往往持续存在并预示致命的结局(Matthayetal.,2003,JClinOncol21,2486-91;Schmidtetal.,2008,EurJCancer44,1552-8)。此外，骨髓复发是常见的，尽管在诱导治疗后可达到几乎完全的缓解。强化治疗的尝试遭遇了急性和长期的副作用，这二者对于年轻患者都是严重的担忧。有前景的新药稀缺，而且迄今为止，极少有(如果有的话)靶/途径特异性小分子已经对NB患者显示了重大临床效应，尽管有希望的前导药物不断累积。对于>18个月龄时确诊的4期患者，在毒性极限下的治愈率<30%，因此还有很大的改善空间(Pearsonetal.,2008,LancetOncol9,247-56)。数种因素使得NB非常适合免疫疗法。首先，在人白细胞存在下MoAb可介导高效率的NB的抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)。其次，MoAb诱导NB细胞的补体介导细胞毒性(CMC)，NB细胞缺少衰变加速因子CD55(Cheungetal.,1988,JClinInvest81,1122-8)和同源的限制因子CD59(Chenetal.,2000,CancerRes60,3013-8)。NB细胞上的补体沉积通过活化中性粒细胞上的iC3b受体而增强ADCC(KushnerandCheung,1992,Blood79,1484-90,Metelitsaetal.,2002,Blood99,4166-73)，如果给予集落刺激因子，则即使在剂量密集的或者骨髓消减性的化疗加上干细胞移植之后其仍然可用(Mackall,CL,2000,StemCells18,10-8)。第三，为达到临床缓解而施用的高强度化疗(NB的护理标准)可导致长期淋巴细胞减少和免疫抑制(Mackalletal.,2000,Blood96,754-762)，使得患者排斥鼠源、嵌合或人源化MoAb的可能性降低(Kushneretal.,2007,PediatrBloodCancer48,430-4)。GD2是一种二唾液酸神经节苷脂(disialoganglioside)，其在神经外胚层起源的肿瘤(包括神经母细胞瘤和黑素瘤)中丰富存在的，而在正常组织中的表达高度受限。至少有两个抗体家族已经得到了临床测试，即3F8(Cheungetal.,1985,CancerRes45,2642-9)和14.18(Mujooetal.,1989,CancerRes49,2857-61)。嵌合ch14.18由鼠MoAb14.18的可变区和人IgG1-K的恒定区组成(Gilliesetal.,1989,JImmunolMethods125,191-202)。它在体内展现NB及黑素瘤细胞的ADCC和CMC(Barkeretal.,1991,CancerRes51,144-9;BarkerandReisfeld,1993,CancerRes.52,362-7;Muelleretal.,1990,PNASUSA87,5702-050)。基于在I期研究中令人鼓舞的临床应答，在大规模II期研究中将ch14.18作为4期NB的巩固治疗进行了测试(德国NB90和NB97研究)。对于确诊时>12个月的166名患者，虽然接受ch14.18的患者的无事件生存(event-freesurvival,EFS)与接受维持化疗的患者相似，但总体生存(overallsurvival,OS)改善，且在用ch14.18治疗的患者中BM复发率降低(Simonetal.,2004,JClinOncol22,3549-57)。在2001年，儿童肿瘤学集团(Children’sOncologyGroup(COG))启动了一项随机化III期实验来研究ch14.18与GMCSF和IL-2的组合在自体干细胞移植(ASCT)后处于完全缓解(CR)中的患者中防止NB复发的效力(ClinicalTrials.govNCT00026312)(Gilmanetal.,JClinOncol27:85-91,2009)，发现无进展生存(PFS)和OS显著提高2年(Yuetal.,NEnglJMed363:1324-1334,2010)。3F8，一种对GD2特异性的鼠IgG3MoAb，诱导细胞死亡，并且在体外介导针对NB的高效的ADCC和CMC(Cheungetal.,2007,同上)。在虽然接受了剂量密集的诱导加上积极的补救疗法仍具有化疗抗性骨髓疾病的患者中，80%的患者通常在1到2个周期的5日抗体加GM-CSF治疗后实现了骨髓缓解(Kushneretal.,2007,ProcAmerSocClinOncol25,526s)。鉴于m3F8对化疗抗性骨髓疾病的活性，m3F8用药被扩展到处于第一次缓解期(firstremission)中的患者，并取得了令人鼓舞的结果。如果在复发风险最高的最先3-5年内给予m3F8作为维持治疗，这些儿童中的有利的临床结果可以改善。然而，当化疗结束，免疫系统恢复时，人抗小鼠抗体应答(HAMA)是一个限制因素。减少HAMA的策略之一是嵌合化或人源化3F8。因此对于这样的嵌合和/或人源化抗体存在需求：其能够以高亲和力结合GD2、优于m3F8、并且能够介导抗体依赖性细胞细胞毒性，从而容许长程抗体疗法以减少疾病复发。本文描述的是嵌合3F8(ch3F8-IgG1)和人源化3F8(hu3F8-IgG1和hu3F8-IgG4)的工程构建和分离。使用标准重组方法制备了这些抗体，并以CHO-DG44细胞系在无血清培养基中的高表达为标准加以选择。使用CHO-Mage1.5细胞系产生了hu3F8-IgG1n的一种特殊糖形(又称hu3F8-IgG1-MAGE1.5)。这种特殊糖形不具有岩藻糖，且只有末端甘露糖和N-乙酰葡萄糖或葡萄糖。使用Biacore系统所使用的表面等离子体共振测量，嵌合3F本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.06.19 US 61/397,9201.一种能够结合GD2的IgG1抗体或其片段，其中所述抗体是人源化或嵌合抗体，其中所述抗体或其片段包含鼠抗体m3F8可变轻链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列和鼠抗体m3F8可变重链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，其中所述抗体或片段能以比m3F8强至少10倍来介导针对神经母细胞瘤LAN-1-PBMC或LAN-1-PMN的ADCC活性，其中所述抗体或片段包含以下任一种：(i)SEQIDNO:1的可变重链域和SEQIDNO:2的可变轻链域；(ii)SEQIDNO:4的可变重链域和SEQIDNO:5的可变轻链域；(iii)SEQIDNO:6的可变重链域和SEQIDNO:7的可变轻链域；(iv)SEQIDNO:6的可变重链域和SEQIDNO:5的可变轻链域；(v)SEQIDNO:4的可变重链域和SEQIDNO:7的可变轻链域；和(vi)SEQIDNO:9的可变重链域和SEQIDNO:10的可变轻链域。2.根据权利要求1的抗体或其片段，其为嵌合抗体或其片段。3.根据权利要求1的抗体或其片段，其为人源化抗体或其片段。4.权利要求1的抗体或其片段，其中所述抗体被末端甘露糖、N-乙酰葡萄糖或葡萄糖糖基化，但无岩藻糖糖基化。5.一种能结合GD2的IgG4抗体或其片段，其中所述抗体是人源化或嵌合抗体，其中所述抗体或其片段包含鼠抗体m3F8可变轻链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列和鼠抗体m3F8可变重链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，其中所述抗体或片段能在大鼠异常性疼痛模型中阻断疼痛，其中所述抗体或片段包含以下任一种：(i)SEQIDNO:3的可变重链域和SEQIDNO:2的可变轻链域；(ii)SEQIDNO:8的可变重链域和SEQIDNO:5的可变轻链域；和(iii)SEQIDNO:8的可变重链域和SEQIDNO:7的可变轻链域。6.根据权利要求5的抗体或其片段，其为嵌合抗体或其片段。7.根据权利要求5的抗体或其片段，其为人源化抗体或其片段。8.权利要求1-7中任一项的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段由包含编码所述抗体或其片段的核酸的重组载体所产生。9.一种分离的核酸分子，其包含编码前述权利要求中任一种抗体的序列。10.一种重组载体，其包含权利要求9的核酸分子。11.一种宿主细胞，其包含权利要求10的重组载体。12.产生根据权利要求1-7中任一项的抗体或其片段的方法，包括在容许所述抗体或其片段表达的条件下在培养基中培养根据权利要求11的宿主细胞，并从所述培...

【专利技术属性】
技术研发人员：N张，M阿麦德，
申请(专利权)人：纪念斯隆凯特林癌症中心，
类型：
国别省市：