本发明专利技术公开了一种对半胱天冬酶3敏感的荧光增强纳米显像剂及其制备方法,特征是通过简单的固相多肽合成获得适当长度的连接物,再通过常规的液相羧氨缩合反应及荧光分子标记反应获得显像剂;该显像剂生理条件下亲水性良好,制备容易,同时由于荧光增强纳米显像剂分子含有半胱天冬酶3特异性识别的寡肽序列,可以被细胞凋亡过程产生的半胱天冬酶3剪切,能够指示细胞是否进入凋亡状态。与现有荧光增强凋亡诊断试剂盒相比,本发明专利技术的制备方法简单,本发明专利技术的酶敏感的荧光增强纳米显像剂生物相容性良好,可以通过对荧光信号的检测在体外环境和细胞裂解液中完成凋亡相关的特定酶活性检测,并能够在活体细胞层面对细胞凋亡状态进行实时监测。
【技术实现步骤摘要】
【技术保护点】
一种对半胱天冬酶3敏感的荧光增强纳米显像剂的制备方法,其特征在于:先合成一段寡肽序列,按:将1毫摩尔2?氯三苯甲基氯树脂在2?3毫升N,N?二甲基甲酰胺里溶胀4?8分钟后,加入2毫摩尔N?芴甲氧羰基?甘氨酸,再加入2毫摩尔N,N?二异丙基乙胺,反应2?3小时后,用100微升甲醇反应5?10分钟,加入按哌啶与N,N?二甲基甲酰胺的体积比为20:80的混合液4?5毫升,切去甘氨酸上的芴甲氧羰基,加入活化的第二个氨基酸1.6毫摩尔N?芴甲氧羰基?甘氨酸反应2?3小时,加入按哌啶与N,N?二甲基甲酰胺的体积比为20:80的混合液4?5毫升,切去甘氨酸的芴甲氧羰基,加入活化的第三个氨基酸1.6毫摩尔N?芴甲氧羰基?甘氨酸反应2?3小时,加入按哌啶与N,N?二甲基甲酰胺的体积比为20:80的混合液4?5毫升,切去甘氨酸的芴甲氧羰基,加入活化的第四个氨基酸1.6毫摩尔N?芴甲氧羰基?L?天冬氨酸?4?叔丁酯反应2?3小时,加入按哌啶与N,N?二甲基甲酰胺的体积比为20:80的混合液4?5毫升,切去天冬氨酸上的芴甲氧羰基,加入活化的第五个氨基酸1.6毫摩尔N?芴甲氧羰基?缬氨酸反应2?3小时,加入按哌啶与N,N?二甲基甲酰胺的体积比为20:80的混合液4?5毫升,切去缬氨酸的芴甲氧羰基,加入活化的第六个氨基酸1.6毫摩尔N?芴甲氧羰基?L?谷氨酸?4?叔丁酯反应2?3小时,最后加入活化的第七个氨基酸1.6毫摩尔N?芴甲氧羰基?L?天冬氨酸?4?叔丁酯反应3?4小时,最后用按三氟乙酸与二氯甲烷的体积比为1:99的混合液40?50毫升从该树脂上切下合成的寡肽片段,用乙醚使其沉淀析出,冷冻离心并倾倒除去上层乙醚,沉淀中乙醚挥发干后所得白色固体粉末即为寡肽序列——甘氨酸?甘氨酸?甘氨酸?天冬氨酸?缬氨酸?谷氨酸?天冬氨酸?芴甲氧羰基;将上述合成的寡肽序列——甘氨酸?甘氨酸?甘氨酸?天冬氨酸?缬氨酸?谷氨酸?天冬氨酸?芴甲氧羰基取0.1毫摩尔溶于2毫升N,N?二甲基甲酰胺中,加入0.12毫摩尔N,N?二异丙基乙胺、0.12毫摩尔苯并三氮唑?N,N,N“,N“?四甲基脲六氟磷酸盐及0.12毫摩尔1?羟基苯并三唑活化半小时后,加入0.12毫摩尔叔丁氧羰基?乙二胺,室温搅拌反应2?3小时,经过高效液相色谱分离提纯,收集在紫外波段300纳米处有特征吸收的组分并浓缩得到白色固体粉末,即为第一种中间产物L1;将上述制备的第一种中间产物L1溶解在按三氟乙酸与二氯甲烷体积比为95:5的10毫升混合液中搅拌反应3小时,经过高效液相色谱分离提纯,收集在紫外波段300纳米处有特征吸收的组分并浓缩得到白色固体粉末,即为第二种中间产物L2;将0.12毫摩尔(4?(4?(二甲基氨基)苯基)偶氮)苯甲酸溶于3毫升N,N?二甲基甲酰胺中,加入0.12毫摩尔N,N?二异丙基乙胺、0.12毫摩尔苯并三氮唑?N,N,N“,N“?四甲基脲六氟磷酸盐及0.12毫摩尔1?羟基苯并三唑活化半小时后,加入第二种中间产物L20.1毫摩尔,室温搅拌反应2?3小时,经过高效液相色谱分离提纯,收集在紫外波段300纳米及可见波段510纳米处有特征吸收的组分并浓缩得到红色固体粉末,即为第三种中间产物CL3;将第三种中间产物CL3取0.1毫摩尔溶解于按哌啶与N,N?二甲基甲酰胺的体积比为5:95的3毫升混合液中,室温搅拌反应二十分钟,经过高效液相色谱分离提纯,收 集仅在可见波段510纳米处有特征吸收的组分并浓缩得到红色固体粉末,即为第四种中间产物CL4;将第四种中间产物CL4取0.1毫摩尔溶解于3毫升pH=9的碳酸钠?碳酸氢钠缓冲溶液中,另取0.12毫摩尔异硫氰酸荧光素异构体I溶解于300微升二甲亚砜中并滴加至第四种中间产物CL4的碳酸钠?碳酸氢钠缓冲溶液中,室温搅拌反应2?3小时,经过高效液相色谱分离提纯,收集在可见波段442纳米及510纳米处有特征吸收的组分并浓缩得到红色固体粉末,即为最终化合物CLY;其中固相肽合成所用的氨基酸都是以9?芴甲氧羰基作为α?氨基保护基,天冬氨酸及谷氨酸的侧链羧基均由4?叔丁酯基保护;其中活化氨基酸的试剂是与氨基酸等摩尔量的1?羟基苯并三唑和苯并三氮唑?N,N,N“,N“?四甲基脲六氟磷酸盐;在每新加入一个氨基酸和切去9?芴甲氧羰基保护基时,都采用凯撒测试(Kaiser?Test)试剂检测氨基存在与否:若阳性,显蓝色,即表明已脱除9?芴甲氧羰基保护基;若阴性,显黄色,则表明氨基酸的氨基已发生缩合反应。FDA00003488015300021.jpg,FDA00003488015300022.jpg...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员:梁高林,唐安明,
申请(专利权)人:中国科学技术大学,
类型:发明
国别省市:
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