通过重组微生物从一氧化碳产生丁醇制造技术

本发明专利技术尤其地涉及能够使用CO产生1-丁醇和/或其前体的新的遗传修饰的微生物、新的甲基转移酶和编码其的核酸、使用所述新的甲基转移酶产生遗传修饰的微生物的方法以及通过微生物发酵产生1-丁醇和/或其前体的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过重组微生物从一氧化碳产生丁醇
本专利技术涉及通过微生物发酵产生生物燃料的方法及适于所述方法的遗传修饰的微生物。
技术介绍
丁醇是一种具有广泛工业用途的重要的大宗化学品，其全球每年的产量是450-550万吨。其可被用作产生丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯（用于涂料、塑料、纺织品、粘合剂等）、乙二醇醚（涂料、电子设备）和乙酸丁酯（油漆（paints）、油墨、涂料、合成水果调味剂）以及丁胺（产生杀虫剂和药物）和氨基树脂的前体。其还可直接用作溶剂（用于油墨、染料等）、萃取剂（用于产生药物和天然物质例如生物碱、抗生素、激素和维生素），以及用于防冻液、化妆品和色谱分析中。丁醇还有潜力作为第二代生物燃料，在本文中称作生物丁醇（&Dürre,2010）。其具有与汽油相似的性质，并且其性质优于乙醇。特别地，由于丁醇具有更高的能量密度其可提高行车里程，其可与汽油以任意浓度混合（而乙醇只能掺和最高达85%）并且不是吸湿性或腐蚀性的。可用于运输的生物燃料是有吸引力的汽油替代品，并且作为低浓度掺和物迅速进入燃料市场。源自天然植物源的生物燃料比源自化石资源的燃料（例如汽油）在环境方面更加可持续，使用其可降低因燃料燃烧而释放到大气中的所谓化石二氧化碳（CO2）气体的水平。此外，生物燃料可在许多地理条件下局部产生，并且其可减少对进口化石能源的依赖。大多数生物燃料是通过传统的基于酵母的发酵过程使用源自作物的碳水化合物作为主要碳源产生的，其被称为第一代生物燃料。但是，这些作物需要被用作食物并且许多作物还需要肥料形式的高农业投入。这些限制意味着第一代生物燃料被认为是不可持续的，并且可实现的温室气体减少是有限的。第二代生物燃料的目标是可持续地使用当前作物的非食物部分或其他工业废物以减少温室气体排放并减少对化石燃料的依赖。近来的1-丁醇生产主要是通过羰基合成（Weiβermel&Arpe,2003）。包括原油的石油化学品被裂解形成用于羰基合成过程中的丙烯。但是，所述合成过程需要使用不可再生资源，并且受制于价格昂贵和所形成产物的形成中的非特异性。丁醇还可通过生物生产方法产生，最常见的是丙酮-丁醇-乙醇（ABE）发酵，其从1913年起即已用于工业（&Dürre,2010）。该方法有不需要的副产物丙酮，通常会产生约为丁醇体积一半的丙酮，因而实质上降低了产率。此外，该发酵方法受限于丁醇对微生物的毒性，这导致在低至1.5%的丁醇浓度下所述微生物的生长几乎被完全抑制（andDürre2010）。此外，ABE发酵使用来自玉米、淀粉、木薯和甘蔗的糖作为原料。这导致不合需要地使用耕地用于产生燃料而不是食物。其还可加重森林采伐和荒漠化相关的问题。已知只有少数生物可天然地产生丁醇，并且其中没有生物可从丰富的资源（例如一氧化碳——CO）以高产率产生丁醇。已知可天然地从CO产生丁醇的两种生物是甲基营养丁酸杆菌（Butyribacteriummethylotrophicum）（其仅合成痕量丁醇（Heiskanenetal,2007））和食一氧化碳梭菌（Clostridiumcarboxidivorans）（相对于主要发酵产物乙醇和乙酸，其产生低产率的1-丁醇作为副产物（Liouetal,2005））。多种生物已被遗传修饰以产生1-丁醇，包括大肠杆菌（E.coli）、枯草杆菌（Bacillussubtilis）、酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）、恶臭假单胞菌（Pseudomonasputida）或者短乳杆菌（Lactobacillusbrevis）。但是，所有这些生物仍然依赖于糖作为原料（&Dürre,2010）。尽管已知有超过250个梭菌种，但是只有少数是遗传上可用的。在梭菌中没有已知的天然感受态（从细胞环境中摄入细胞外DNA），电转化或接合是仅有的用于转化的方法。这些问题是有效转化梭菌种的显著困难。大多数梭菌具有一种或多种限制性/甲基化系统以抵御外源DNA和噬菌体DNA，这意味着转化尤其困难和不可预测。本文所引用出版物的书目细节见本说明书末尾部分。本专利技术的目标是克服现有技术的一种或多种缺陷，或者至少为公众提供已知技术的可用的替代。
技术实现思路
根据本专利技术，已经发现，遗传修饰的微生物能够使用CO来产生1-丁醇或其前体作为主要的发酵产物。在第一方面，本专利技术提供了一种产生1-丁醇和/或其前体作为主要发酵产物的一氧化碳营养的产乙酸重组微生物。在一个相关的方面，本专利技术提供了一种能够通过发酵从含CO的底物以大于约1mM或0.075g/l升发酵液的浓度产生1-丁醇和/或其前体的产乙酸重组微生物。优选地，所述微生物包含适于表达丁醇生物合成途径中的一种或多种酶的外源核酸。在一个实施方案中，所述一种或多种酶选自：硫解酶3-羟基丁烷酰-CoA脱氢酶巴豆酸酶/巴豆酰-CoA水合酶丁酰-CoA脱氢酶电子转移黄素蛋白A电子转移黄素蛋白B优选地，所述微生物包含编码一种或多种所述酶的一种或多种外源核酸。优选地，所述编码一种或多种酶的一种或多种核酸选自核酸SEQIDNO.1到SEQIDNO.6或其功能上等价的变体。优选地，所述微生物包含编码硫解酶、3-羟基丁烷酰-CoA脱氢酶、巴豆酸酶、丁酰-CoA脱氢酶、电子转移黄素蛋白A和电子转移黄素蛋白B的每一种的一种或多种外源核酸。优选地，所述微生物包含编码硫解酶、3-羟基丁烷酰-CoA脱氢酶、巴豆酸酶、丁酰-CoA脱氢酶、电子转移黄素蛋白A和电子转移黄素蛋白B中的一种或多种，或者优选每一种的质粒。在一个实施方案中，所述微生物包含编码硫解酶、3-羟基丁烷酰-CoA脱氢酶、巴豆酸酶/巴豆酰-CoA水合酶和丁酰-CoA脱氢酶中每一种的一种或多种外源核酸。优选地，所述微生物还包含外源的磷酸转乙酰酶/乙酸激酶启动子。优选地，所述启动子对应于SEQ_IDNo.7或其功能等价变体。优选地，所述启动子被包含在编码一种或多种上述酶的构建体中。在一个实施方案中，所述微生物包含适于表达一种或多种酶的外源核酸，所述酶选自：磷酸转丁酰酶（Phosphotransbutyrylase）；丁酸激酶；铁氧还蛋白依赖的醛氧化还原酶；丁醛脱氢酶；丁醇脱氢酶；双功能丁醛脱氢酶和丁醇脱氢酶。在一个实施方案中，所述微生物包含适于表达丁醛脱氢酶、丁醇脱氢酶和双功能丁醛脱氢酶/丁醇脱氢酶中的一种或多种的外源核酸。优选地，所述微生物包含编码丁醛脱氢酶、丁醇脱氢酶和双功能丁醛脱氢酶/丁醇脱氢酶中的一种或多种的外源核酸。在一个实施方案中，所述微生物包含适于表达磷酸转丁酰酶、丁酸激酶、铁氧还蛋白依赖的醛氧化还原酶和丁醇脱氢酶中的一种或多种的外源核酸。优选地，所述微生物包含编码磷酸转丁酰酶、丁酸激酶、铁氧还蛋白依赖的醛氧化还原酶和丁醇脱氢酶中的一种或多种的一种或多种外源核酸。在具体实施方案中，所述微生物包含适于表达磷酸转丁酰酶、丁酸激酶、铁氧还蛋白依赖的醛氧化还原酶和丁醇脱氢酶中的每一种的外源核酸。在一个实施方案中，编码所述一种或多种酶的所述一种或多种核酸选自下文表7至10中所列举的核酸及其功能等价变体。在一个实施方案中，所述微生物包含适于表达丁醇生物合成途径中至少2种酶、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.10.22 US 61/405,871;2011.03.16 US 13/049,2631.一种产乙酸重组微生物，其包括外源硫解酶、外源3-羟基丁烷酰-CoA脱氢酶、外源巴豆酸酶/巴豆酰-CoA水合酶、外源丁酰-CoA脱氢酶以及外源电子转移黄素蛋白A和B，其中所述微生物来源自选自以下的亲代微生物：自产醇梭菌(Clostridiumautoethanogenum)和扬氏梭菌(Clostridiumljungdahlii)。2.权利要求1的产乙酸重组微生物，其中所述微生物产生丁酰-CoA。3.权利要求1的产乙酸重组微生物，其中所述微生物还包括外源磷酸转丁酰酶和外源丁酸激酶。4.权利要求3的产乙酸重组微生物，其中所述微生物产生丁酸。5.权利要求3的产乙酸重组微生物，其中所述微生物还包括内源或外源铁氧还蛋白依赖的醛氧化还原酶。6.权利要求1的产乙酸重组微生物，其中所述微生物还包括外源丁醛脱氢酶。7.权利要求5或6的产乙酸重组微生物...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·科普克，F·刘，S·辛普森，
申请(专利权)人：新西兰郎泽科技公司，
类型：
国别省市：