HBV表型耐药检测试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种HBV表型耐药检测试剂盒，该试剂盒包括可以置换HBV1.0片段的重组入门载体pcDNA6.2-HBV1.1-sapI载体，其碱基序列如SEQ?ID?No.4所示，和带有分泌性碱性磷酸酶的双表达载体pcDNA5AP-attR载体，其碱基序列如SEQ?ID?No.6所示。本发明专利技术提供的耐药检测试剂盒主要包括一套基于GatewayTM重组的表达载体系统，该重组系统避免了限制性内切酶位点对克隆地限制，可以快速、正确地将目的片段引入表达载体，并且可利用培养基上清进行化学发光定量检测，不仅灵敏度高而且可以根据标准碱性磷酸酶的对照进行定量和校准，操作简便，稳定。

【技术实现步骤摘要】
HBV表型耐药检测试剂盒及其制备方法
本专利技术涉及一种耐药检测试剂盒，具体地说，涉及一种用于HBV（乙肝病毒）、针对现有各种NAs药物的表型耐药检测试剂盒。同时，本专利技术也涉及该HBV表型耐药检测试剂盒的制备方法。
技术介绍
慢性乙型肝炎（CHB）是全球范围内重要的医学和公共卫生问题，目前全世界约有4亿人受其影响。高达40％的CHB可能发生肝硬化、失代偿性肝病和肝细胞肝癌（HCC）等并发症。目前，可用于治疗慢性乙型肝炎（CHB）的药物包括免疫调节剂（如干扰素-α）和口服核苷/核苷酸类似物（NAs），包括拉米夫定、拉米夫定、替比夫定、恩替卡韦和替诺福韦。由于口服NAs具有强大的病毒抑制效果和每日单剂量用药比较容易并且没有明显的副作用，现已成为慢性乙型肝炎治疗的主要方法。但是，NAs治疗的一个主要的缺点是长期治疗产生耐药性突变。NAs耐药的患者会出现病毒学突破以致病情恶化。因此，如何早期准确地检测HBV耐药变异具有重要的意义，对于HBV耐药检测试剂盒的研发也是十分必要的。基因型耐药是指通过测序等手段检测已通过表型分析证实的与NAs耐药相关的基因变异；而表型耐药是指通过体外病毒复制系统证实变异HBV对NAs敏感性降低，其是判定体内病毒是否耐药的最直接证据。目前，绝大多数HBV表型耐药检测方法的主要瓶颈有：1.将HBV基因组克隆进入表达载体过程较慢；2.HBV病毒载体体外转染缺乏有效、准确的校准系统，虽然大都采用外在的带有标签蛋白的示踪载体与HBV载体共转染细胞的方法来校准转染效率，然而这种方法很不稳定。
技术实现思路
本专利技术所要解决的第一个技术问题是提供一种用于HBV、针对现有各种NAs药物的表型耐药检测试剂盒。本专利技术所要解决的第二个技术问题是提供上述用于HBV、针对现有各种NAs药物的表型耐药检测试剂盒的制备方法。为了解决上述第一个技术问题，本专利技术提供了一种HBV表型耐药检测试剂盒，所述试剂盒包括可以置换HBV1.0片段的重组入门载体和带有分泌性碱性磷酸酶的双表达载体。作为一个优选方案，所述可以置换HBV1.0片段的重组入门载体为pcDNA6.2-HBV1.1-sapI载体，其碱基序列如SEQIDNo.4所示；所述带有分泌性碱性磷酸酶的双表达载体为pcDNA5AP-attR载体，其碱基序列如SEQIDNo.6所示。为了解决上述第二个技术问题，本专利技术提供所述HBV表型耐药检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述pcDNA6.2-HBV1.1-sapI载体和pcDNA5AP-attR载体的构建包括以下步骤：（1）pcDNA6.2-HBV1.1-sapI载体构建（1.1）扩增pMD18T自连载体多克隆位点区，引物如下；6.2-salI-s：5’-ACGCGTCGACCGAAAGGGGGATGTG-3’（SEQIDNo.8所示）；6.2-salI-as：5’-ACGCTCGAGGAGCTCGGTACCCGG-3’（SEQIDNo.9所示）；以pMD18T自连载体为模板扩增，扩增序列如SEQIDNo.1所示；（1.2）把pcDNA6.2miR/GW载体用salI和xhoI双酶切，与上述扩增产物连接形成pcDNA6.2-msc载体，序列如SEQIDNo.2所示；（1.3）扩增HBV1.1片段，引物如下：HBV-salI-s：ATAGCGTCGACCACCAGCACCATGC（SEQIDNo.10所示）；HBV-hindIII-as：AAGGGAACAAAAGCTGGTACCGGGC（SEQIDNo.11所示）；以HBV1.1质粒为模板扩增，扩增片段中不含常用的限制性酶切位点，扩增序列如SEQIDNo.3所示；（1.4）SalI和hindIII双酶切步骤（1.2）扩增的HBV1.1后，插入到pcDNA6.2-msc载体中；（1.5）设计突变引物HBV-QuickChange-S：5'-CACCAGCACCATGCAACGCTCTTCTTTTTCACCTCTGCC-3'（SEQIDNo.12所示）；HBV-QuickChange-AS：5'-GGCAGAGGTGAAAAAGAAGAGCGTTGCATGGTGCTGGTG-3'（SEQIDNo.13所示）；把HBV1.0基因3’末端引入sapI酶切位点GCTCTTC，经DpnI消化突变后形成pcDNA6.2-HBV1.1-sapI载体，序列如SEQIDNo.4所示；（2）pcDNA5AP-attR载体构建（2.1）以plenti6-dest载体为模板，扩增片段如SEQIDNo.5所示，引物为：attR-aflII-s：5’-gggcttaagataagcagagctcgtt-3’（SEQIDNo.14所示）；attR-apaI-as：5’-taccgggcccattactaaccggtacgc-3’（SEQIDNo.15所示）；（2.2）aflII和apaI双酶切上述扩增片段，定向连接到pcDNA5AP-TA载体上，形成pcDNA5AP-attR载体，如SEQIDNo.6所示。本专利技术的技术思路基于下述三方面的考虑。第一，在乙型肝炎临床治疗工作中，表型耐药检测能够为患者的治疗方案的制定提供重要依据；第二，目前绝大多数表型耐药检测在HBV基因组克隆进入载体时多采用的传统的酶切连接克隆手段，该方法受到载体和目的基因上酶切位点的限制，因而载体的选择范围窄，HBV作为目的基因由于亚型很多一旦某个亚型的限制酶切位点不合适则不能进行克隆，导致目的基因检测范围也窄，另外由于HBV1.0基因片段较大该方法效率也受到限制。我们所利用的GatewayTM重组是克隆和亚克隆DNA序列的一项新颖的通用系统，这项强大的体外技术大大提高了克隆效率（高达95％或更高），并且可以将目的基因通过平行反应转移到一个或更多个目的载体；第三，目前大多数HBV表型耐药检测方法只能依靠外在的示踪载体与HBV载体共转染的方法来校准转染效率，该方法不够稳定、准确，我们将分泌性碱性磷酸酶作为示踪基因和HBV目的基因放在同一个表达载体上，有利于实现更稳定、更准确地校准HBV的转染、转录复制。为实现这一目标，我们将利用GatewayTM重组技术将HBV基因组克隆到带有分泌性碱性磷酸酶的示踪的表达载体，构成HBV1.1拷贝基因和分泌性碱性磷酸酶基因双表达载体，转染HepG2细胞后以碱性磷酸酶为校准系统进行表型耐药检测。本专利技术的优点在于：（1）本专利技术提供的耐药检测试剂盒主要包括一套基于GatewayTM重组的表达载体系统，该系统包含带有分泌性碱性磷酸酶的双表达载体、可以置换HBV1.0片段的重组入门载体；（2）该重组系统避免了限制性内切酶位点对克隆地限制，可以快速、正确地将目的片段引入表达载体；（3）该耐药检测载体系统可利用培养基上清进行化学发光定量检测，不仅灵敏度高而且可以根据标准碱性磷酸酶的对照进行定量和校准，操作简便，稳定。附图说明图1为pcDNA6.2-msc载体结构图；图2为pcDNA6.2-HBV1.1-sapI载体结构图；图3为pcDNA5AP-attR载体结构图；图4为pcDNA5AP-HBV1.1载体结构图；图5为HBsAg、SEAP-表达水平及相关性；图6为HBVDNA、SEAP-表达水平；图7为HBV野生株本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种HBV表型耐药检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括可以置换HBV1.0片段的重组入门载体和带有分泌性碱性磷酸酶的双表达载体。

【技术特征摘要】
1.一种HBV表型耐药检测试剂盒，其特征在于包括可以置换HBV1.0片段的重组入门载体和带有分泌性碱性磷酸酶的双表达载体；所述可以置换HBV1.0片段的重组入门载体为pcDNA6.2-HBV1.1-sapI载体，其碱基序列如SEQIDNo.4所示；所述带有分泌性碱性磷酸酶的双表达载体为pcDNA5AP-attR载体，其碱基序列如SEQIDNo.6所示；引物如下：HBV1.0-as：TAGTGGAAGCTTGACCATGGTGAGCAAGGGCGAG；HBV1.0-s：GCTTGGGATCCAATTCTTACTTGTACAGCTCG。2.权利要求1所述HBV表型耐药检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述pcDNA6.2-HBV1.1-sapI载体和pcDNA5AP-attR载体的构建包括以下步骤：(1)pcDNA6.2-HBV1.1-sapI载体构建(1.1)扩增pMD18T自连载体多克隆位点区，引物如下：6.2-salI-s：5’-ACGCGTCGACCGAAAGGGGGATGTG-3’；6.2-salI-as：5’-ACGCTCGAGGAGCTCGGTACCCGG-3’；以pMD18T自连载体为模板扩增，扩增序列如SEQIDNo.1所示；(1.2)把pcDNA6.2miR/GW载体用salI和xhoI双酶切，与上述扩增产物连接形成pcDNA6.2-msc载体，序列如SEQIDNo.2所示；(1.3)扩增HBV1.1片段，引物如下：HBV-sal...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈德喜，乔录新，魏飞力，张玉林，刘道洁，刘秀红，李庆，丁渭，徐树莹，宋凤丽，李宁，
申请(专利权)人：北京市肝病研究所，首都医科大学附属北京佑安医院，
类型：发明
国别省市：