一种肝靶向肽与重组人内皮抑素融合蛋白及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种肝靶向肽与重组人内皮抑素融合蛋白及其制备方法与应用。本发明专利技术选用疟原虫环子孢子蛋白CSPN端保守I区可与肝细胞表面的受体---硫酸乙酰肝素蛋白聚糖HSPG特异性地结合的19个氨基酸，利用基因工程方法将其融合在氨基末端加有9个氨基酸序列(MGGSHHHHH)的新型人内皮抑素nhES的羧基末端，制备得到肝靶向肽与重组人内皮抑素融合蛋白(ES-CSP)。该融合蛋白易于纯化，能特异靶向于肝脏抑制新生血管形成，提高药物在病灶部位的局部浓度，减少全身用量，降低其毒副作用。为临床上开发靶向抑制血管生成治疗肝癌药物提供思路和科学依据，对进一步提高我国肝癌的治疗水平具有巨大的科学意义和实用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种肝靶向肽与重组人内皮抑素融合蛋白及其制备方法与应用
本专利技术属于医药生物
，更具体地，涉及一种肝靶向肽与重组人内皮抑素融合蛋白及其制备方法与应用。
技术介绍
原发性肝癌(HCC)是我国主要的恶性肿瘤之一，年发病率为10~150/10万人，仅次于肺癌和胃癌，是我国第三位的恶性肿瘤，其年死亡率约34.6/10万人，仅次于肺癌，居第二位。原发性肝癌也是肝硬化患者的主要死亡原因。其在全世界也属于常见病，原发性肝癌在恶性肿瘤发病率中居世界第5位，死亡率居第3位。目前，我国每年新发原发性肝癌约35万例，占全世界新发病例的55%。每年死于原发性肝癌的人数约32万人，占全世界原发性肝癌总死亡人数的45%。目前，原发性肝癌的高发病率，高病死率及其逐年增高的趋势，已成为一个非常严重的国际卫生问题，严重危害了人类的健康。开展创新药物与治疗新靶标的研究对改善肝癌治疗现状具有重要意义。实体肿瘤的生长和转移依赖于新生血管生成学说的提出，为肿瘤治疗开辟了一个新的途径。目前，以肿瘤血管生成为靶点，通过肿瘤血管生成抑制剂(tumorangiogenesisinhibitors，TAI)抑制或破坏肿瘤血管生成，切断肿瘤营养来源而“饿死”肿瘤的癌症新疗法已成为研究热点。根据干预环节的不同，抗血管生成药物分为5类：（1）抑制内皮细胞增生或迁移，如血管抑素(Angiostatin)和内皮抑素(Endostatin)；（2）阻止血管内皮细胞外基质降解，如基质金属蛋白酶抑制剂；（3）阻断血管内皮生长因子VEGF和(或)血管内皮生长因子受体VEGFR的产生，如抗VEGF单克隆抗体Becacizumab，VEGFR的酪氨酸抑制剂Sunitinib（SU011248)、Sorafenib(BAY43-9006)及Axitinib(AG-013736)等；（4）干扰VEGF和VEGFR的相互作用，如VEGFR选择性抑制剂SU1498、ZD6474等；（5）抑制胞内信号转导分子从而阻断VEGF/VEGFR信号通路，如胞内信号转导分子PI-3K抑制剂LY94002等。肝癌是血管丰富的实体性肿瘤，大多数肝癌有血管异常增生的现象。在肝癌细胞及其周边的间质中经常发现多种促血管生成的因子过度表达，如血管内皮生长因子(VEGF)、碱性纤维母细胞生长因子(bFGF)、血小板相关生长因子(PDGF)和基质金属蛋白酶（MMP）等。目前，临床上治疗HCC的抗血管生成药物多是阻断血管内皮生长因子VEGF和(或)血管内皮生长因子受体VEGFR信号通路的酪氨酸激酶抑制剂或抗体，容易产生耐药性。内皮抑素(Endostatin，ES)是由细胞外基质成分胶原ⅩⅧ的羧基末端水解而来的一种动物体内天然存在的蛋白，是一种内源性血管形成抑制因子，能有效地抑制机体内病理性血管的形成，具有广谱的抗肿瘤作用。临床研究发现，Down’s综合症病人的ES表达水平较高，实体瘤发病率很低；癌症患者血清中ES的含量有利于总生存时间的延长。体外研究发现，ES特异性地抑制微血管内皮细胞的增殖、迁移、粘附和存活，能有效地抑制鸡胚尿囊膜(CAM)新生血管的形成，而实验性动物研究也证实ES有显著的抗肿瘤作用。目前发现ES可以和内皮细胞（ECs）表面多个非特异性受体结合，抑制ECs在血管形成中的作用。例如：ES以低亲和力结合ECs表面的HS、Glypican-1以及Glypican-4，诱导整合素α5β1(integrinα5β1)、HSP和锚定蛋白Caveolin聚集，活化RhoGAP磷酸酶，使Actin应力纤维和黏着斑解聚，产生抗迁徙和抑制血管形成的作用；ES与纤连蛋白(Fibronectin，FN)竞争性地结合ECs表面的Integrinα5β1，抑制黏着斑激酶(focaladhesionkinase，FAK)/丝裂原活化的蛋白激酶l(mitogen-activatedproteinkinasel，MAPKl)/细胞外信号调节激酶1(extracellularsignalregulatedkinasel，ERKl)信号传导途径，损害ECs与基质之间的相互作用，从而降低ECs迁徙和黏附功能；ES结合VEGF受体KDR(kinaseinsertdomaincontainingreceptor，KDR)细胞膜外的结构域，阻断VEGF/VEGFR信号途径，抑制ECs增殖和迁徙。ES也能直接进入ECs，或者与管周细胞以及细胞外基质成分相互作用，通过调节效应蛋白的表达和活性发挥作用。例如：Es能下调ECs中BCL-2和BCL-XL等抗凋亡蛋白的表达，诱导ECs凋亡；ES抑制某些肿瘤相关的基质金属蛋白酶原(promatrixmetalloproteinases，proMMPs)的激活和水解活性，并MMP-2活性部位结合成稳定的复合物，抑制内皮细胞迁徙和肿瘤细胞侵袭。DNA微阵列研究揭示ES下调了的促血管形成信号通路，包括：调节细胞增殖的Id和AP-1信号、乏氧和代谢适应的HIF-1a信号、参与细胞迁徙的ephrin和TNF-a信号、增殖和抗凋亡NF-κB信号、调节细胞增殖和迁徙的STAT信号、迁徙和抗凋亡的Ets信号以及凝血级联和黏附分子通路。美国EntreMed公司采用毕赤酵母表达系统生产了人内皮抑素，并开展了I、II期临床试验。结果表明ES有良好的安全性，部分难治性晚期肿瘤在药物使用过程中处于稳定状态，少数病例肿瘤缓慢缩小。我国以大肠杆菌表达系统生产了新型重组人内皮抑素(recombinanthumanendostatin，rh-ES，商品名Endostar，恩度)，其氨基末端经过基因修饰加上了9个氨基酸序列(MGGSHHHHH)，形成6个组氨酸标签，从而简化了纯化工艺，蛋白质活性和稳定性也有了明显提高。中国食品药品监督管理局(SFDA)在2005年9月批准了恩度联合NP(诺维本+顺铂)方案治疗晚期非小细胞肺癌(non-smallcelllungcarcinoma，NSCLC)的适应症。目前临床上已将恩度与放疗、化疗联合用于治疗多种肿瘤。但治疗时恩度在体内容易扩散降解，导致相对平均的组织分布，未能在病灶部位形成有效的抗肿瘤浓度，为了达到临床效果，只有加大药物剂量；然而，加大剂量会引起较严重的毒副作用，如心脏功能受损、腹泻等，尤其是对胚胎形成、伤口愈合等生理状态下的血管形成存在潜在的不良影响。提高ES的器官靶向性，将药物有效地输送至病变部位，可提高药物的治疗指数，减少其毒副作用。有研究发现，将肿瘤靶向肽Arg-Gly-Asp(RGD)或肿瘤穿膜肽CRGDKGPDC融合到ESN端多肽片段或ESC端上，可增强ES多肽及ES体内抗肿瘤的功能。环子孢子蛋白（Circumsporozoiteprotein,CSP）是疟原虫子孢子表面一种重要的抗原，子孢子利用其与肝细胞表面受体相互作用从而识别、粘附在肝细胞表面。通过静脉注射，重组CSP在几分钟内就能结合到肝细胞表面，表明CSP有高效而特异的肝细胞靶向性。CSP约含400个氨基酸，由N端保守I区、中央重复区和C端保守Ⅱ区构成。近年研究显示CSPN端保守I区可与肝细胞表面的受体---硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparansulfateproteoglycans，HSPG本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肝靶向肽与重组人内皮抑素融合蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.一种肝靶向肽与重组人内皮抑素融合蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。2.一种权利要求1所述肝靶向肽与重组人内皮抑素融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：S1.肝靶向肽与重组人内皮抑素融合蛋白基因构建：利用SOE-PCR方法在人内皮抑素基因的羧基端加入核苷酸序列如SEQIDNO：3所示的CSPI-plus基因序列，在内皮抑素基因氨基端加入核苷酸如SEQIDNO：4所示的基因片段；S2.将上述融合蛋白基因构建重组表达载体；S3.将重组表达载体转化宿主细胞，获得表达融合蛋白的工程菌，发酵培养；S4.纯化分离得到肝靶向肽与重组人内皮抑素融合蛋白；S1所述融合蛋白基因构建中利用SOE-PCR方法在人内皮抑素基因的羧基端和氨基端还分别加入酶切位点序列；其中，S1所述融合蛋白基因构建具体步骤为：先以引物组1扩增出人内皮抑素基因，再以引物组2和引物组3采用SOE-PCR方法在人内皮抑素基因的羧基端加入核苷酸序列如SEQIDNO：3所示的CSPI-plus基因序列，在内皮抑素基因氨基端加入核苷酸如SEQIDNO：4所示的基因片段，引物组1由引物P1和P2组成，引物组2由引物P3和P4组成，引物组3由引物P3和P5组成，引物P1、P2、P3、P4和P5的核苷酸序列如...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱家勇，马艳，金小宝，卢雪梅，
申请(专利权)人：广东药学院，
类型：发明
国别省市：