一种适合于双向电泳的大小鼠睾丸组织样品全蛋白提取和分离的方法技术

本发明专利技术公开了一种适合于双向电泳的大小鼠睾丸组织样品全蛋白提取和分离的方法，包括大小鼠睾丸组织处理、睾丸组织全蛋白样品制备方法、双向电泳技术体系、凝胶的染色和图谱分析，本发明专利技术方法将繁琐的、稳定性较差的通用双向电泳技术体系进行了优化，大大减少了摸索条件的时间和试剂消耗，节省了实验成本，获得了满意的便于后续分析的双向电泳图谱，较目前通用的匀浆液提取法、裂解液提取法、裂解液提取/丙酮沉淀法更适合大小鼠睾丸组织蛋白样品的提取，在不增加试剂成本的前提下，不仅减少了蛋白的降解，而且增加了蛋白的溶解性，从而获得蛋白点较多且清晰水平条纹，重复性较好的双向电泳图谱。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种适合于双向电泳的大小鼠睾丸组织样品全蛋白提取和分离的方法，其步骤如下：（1）将实验大小鼠放入盛有乙醚的箱内，待其窒息后，固定于解剖盘，切开阴囊，剥离其周围组织，摘除睾丸，并用超纯水冲洗，然后去除被膜，称重；（2）将（1）处理的睾丸组织与预冷的组织样品蛋白裂解液以质量体积比为1:5的比例混合后，电动组织匀浆仪11,000?rpm匀浆，每次10s,间隔1min,连续3?5次，直至体系呈均质状悬浊液，整个过程样品管始终置于冰浴中；（3）将（2）处理后的悬浊液在室温下静置1h，使蛋白充分溶解，然后在4℃、16000g离心1?h，然后吸取上清液，用Bradford法测定得上清液的蛋白浓度，根据测定结果将上清液按体积分装3?4份，使每份上清液的蛋白含量保持至400?500ug；?（4）将（3）所得上清液与5倍体积的80%预冷丙酮混匀，?18―?20℃放置15min－60min；（5）将（4）处理液在4℃、16,000g离心5min，弃去上清，置于超净工作台中正置,?微风吹拂10s?30s，得待溶解的沉淀蛋白样品；（6）取?20℃冷冻保存的水化上样缓冲液1ml置1.5ml?EP管中，室温溶解后，加入0.01g?DTT,?2.5mL?Bio?Lyte?4?6，2.5mL?Bio?Lyte?5?7，充分混匀，取出400ml，加入（6）得沉淀蛋白样品中，充分溶解，混匀；（7）用移液抢将（6）得到的蛋白样品从左至右沿着边缘线性加入到聚焦盘中，保持槽中间的样品液连贯，槽两端各留1－1.2cm距离，同时，在聚焦盘电极的两侧分别放置盐桥，并用10uL的超纯水浸湿，然后将水化好的胶条转入聚焦盘中，胶面朝下，正负极对应，沿着每根胶条上缓慢的加入2?3mL矿物油，与聚焦槽的正负极对好，盖上盖子；（8）将（7）处理后的胶条，进行等电聚焦，设置等电聚焦程序为：S1?250V?线性30min，S2?1000V?快速1h，S3?10000V?线性5h，S4?10000V?快速60,000伏小时，?S5?500V快速任意时间；?（9）将（8）聚焦程序结束后，立即分别用胶条平衡缓冲液Ⅰ和胶条平衡缓冲液Ⅱ进行胶条平衡，平衡缓冲液按5ml/gel加入，平衡时间为12?15min；（10）将（9）聚焦后的胶条立即进行第二向SDS?PAGE电泳，步骤为：配制12%的丙烯酰胺凝胶,每块凝胶用凝胶液40?42ml，注入玻璃板夹层中，上部留1cm的空间，用水饱和正丁醇封面，保持胶面平整，聚合30分钟，在电泳槽加入1×电泳缓冲液后，接通电源，起始时用16mA/gel/17cm的低电流，待样品在完全走出IPG胶条，浓缩成一条线后，再加大电流至24?30mA/gel/17cm，持续5.5－6小时,即可停止电泳；?(11)取出（10）处理后的凝胶进行考马斯亮蓝G?250染色，染色好凝胶放入透射扫描仪中扫描，制图，并用专用分析软件进行分析。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张建海，罗广营，牛瑞燕，王金明，孙子龙，王俊东，
申请(专利权)人：山西农业大学，
类型：发明
国别省市：