猪圆环病毒2型、猪支原体肺炎二联灭活疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种猪圆环病毒2型、猪支原体肺炎二联灭活疫苗，其含有灭活的猪圆环病毒2型抗原和灭活的猪肺炎支原体（Mycoplasma?hyopneumoniae）以及油佐剂，其中，所述的猪肺炎支原体为DJ-166株，保藏号为CGMCC?No.4545。本发明专利技术提供的猪用二联灭活疫苗在预防猪圆环病毒2型和猪支原体肺炎方面表现出显著的技术效果。安全性试验显示，疫苗单剂量、单剂量重复、超剂量接种试验动物后安全，体温、精神状态正常，无任何临床症状；效力试验显示，本发明专利技术疫苗对猪圆环病毒2型和猪肺炎支原体的强毒攻击有良好的保护作用，可有效的预防猪圆环病毒2型和猪支原体肺炎。

【技术实现步骤摘要】
猪圆环病毒2型、猪支原体肺炎二联灭活疫苗及其制备方法
本专利技术属于兽用生物制品领域，具体涉及猪圆环病毒2型、猪支原体肺炎二联灭活疫苗及其制备方法。
技术介绍
猪支原体肺炎（Mycoplasmahyopneumoniaeofswine，MPS）又称猪地方流行性肺炎或猪喘气病，由猪肺炎支原体（Mycoplasmahyopneumoniae，Mhyo）引起的猪接触性慢性呼吸道疾病，呈全世界广泛流行，是严重危害养猪业健康发展的主要猪病之一。猪支原体肺炎死亡率虽然不高，但由于流行的广泛性、长期性和消耗性，可使饲料转化率降低，并引起猪的多种并发病，是造成养猪业经济损失的最重要的疾病之一。目前用于猪支原体肺炎免疫的疫苗有两种，即灭活疫苗和弱毒疫苗。国外厂家生产的多为灭活疫苗，以佐剂克服灭活疫苗的不足，因为肌肉接种，使用方便，但是价格昂贵，且免疫效果方面与国内存在差异。国内生产的弱毒疫苗可以产生较强的局部粘膜免疫力和细胞免疫力，免疫期较长，但需要胸腔内注射，使用不方便，有一定的接种副反应，并且要求疫苗免疫后一周内避免使用抗菌素。因此如何获得一种符合国内猪支原体肺炎流行状况且免疫原性好、保护效果好的灭活疫苗是当务之急。另外，猪支原体肺炎感染后可引起猪体的免疫抑制，导致猪体的免疫功能下降，对猪的巨噬细胞、T细胞和B细胞的功能均有抑制。因此，猪群一旦发生猪支原体肺炎感染，就很容易与其它病毒和细菌发生混合感染，以猪圆环病毒2型（PorcineCircovirustype2，PCV2）最为常见。而现阶段，国内还没有猪圆环病毒2型、猪支原体肺炎的二联灭活疫苗上市，因此一种能防治猪支原体肺炎和猪圆环病毒2型混合感染的疫苗也是必不可少的。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供一种猪圆环病毒2型、猪支原体肺炎二联灭活疫苗及其制备方法和应用。首先，本专利技术提供一种猪圆环病毒2型、猪支原体肺炎二联灭活疫苗，其含有灭活的猪圆环病毒2型抗原和灭活的猪肺炎支原体（Mycoplasmahyopneumoniae）抗原以及油佐剂，其中，所述的猪肺炎支原体为DJ-166株，保藏号为CGMCCNo.4545。其中，所述的油佐剂为MontanideISA50V2佐剂。其中，所述的灭活的猪肺炎支原体DJ-166株抗原含量不低于109CCU/ml。其中，所述的灭活的猪圆环病毒2型抗原的含量不低于106.5TCID50/ml。本专利技术提供的二联灭活疫苗，其含有的两种抗原之间基本上无干扰现象。“基本上无干扰现象”是指，所述的二联灭活疫苗在免疫猪以后，两种抗原之间不会显著削弱对方的免疫效果。本专利技术还提供所述的二联灭活疫苗的制备方法，其包括如下步骤：1）分别增殖浓缩猪圆环病毒2型毒液和猪肺炎支原体菌液；2）分别灭活猪圆环病毒2型浓缩毒液和猪肺炎支原体浓缩菌液；3）制备油相：将MontanideISA50V2佐剂装入灭菌瓶内，121℃灭菌30分钟；4）制备水相：用步骤2）的灭活PCV2浓缩毒液稀释步骤2）的灭活Mhyo浓缩菌液，使水相中PCV2抗原含量至少为106.3TCID50/ml、Mhyo抗原含量为300～350μg/ml；（5）乳化：将水相成分与油相成分按1:1配比乳化，先将油相加入剪切机内，2000r/min搅拌的同时缓缓加入水相，再以5000r/min搅拌30分钟，终止搅拌前加入1.0%硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01%。其中，所述的猪圆环病毒2型的繁殖方法包括如下步骤：1）将猪圆环病毒2型用生长液作1:3稀释，然后按5%（V/V）的比例接种已长满80%-100%单层PK-15A细胞，37℃吸附30分钟，加入细胞维持液37℃培养72小时；2）猪圆环病毒2型的浓缩及纯化：倒掉细胞维持液，加入1/10细胞维持液体积的0.01mo1/LPBS，置-15℃/室温反复冻融后收获，3000r/min离心20分钟，取上清。猪圆环病毒2型（DNB-SX07株）毒种每1ml病毒含量应不低于106.2TCID50；所述生长液为含有8%新生牛血清的MEM营养液，所述维持液为含有2%新生牛血清的MEM营养液。其中，所述的猪肺炎支原体增殖方法包括如下步骤：1）猪肺炎支原体的繁殖：将猪肺炎支原体按10%（V/V）的比例接种猪肺炎支原体液体培养基，37℃培养9日，培养基颜色变黄，pH降至6.8时收获菌液；2）猪肺炎支原体的浓缩及纯化：用超滤膜系统将支原体菌液进行浓缩，使猪肺炎支原体菌液浓度达到1011～1012CCU/ml；将浓缩后的菌液低速离心弃沉淀；将上清高速离心，弃上清，沉淀用pH值7.2Tris-NaCl缓冲液悬浮，反复3次，最后用pH值7.2的Tris-NaCl缓冲液重悬至原体积1%。其中，所述的猪圆环病毒2型灭活方法包括如下步骤：将浓缩的病毒液按1:4000（V/V）的比例加入β-丙内酯，在2～8℃下持续24小时，期间每4小时振摇1次，再经37℃水解2小时，灭活终止。其中，所述猪肺炎支原体灭活方法包括如下步骤：给已浓缩的菌液加入浓度1.0%硫柳汞溶液，使菌液中硫柳汞的浓度达到0.01%，在2～8℃下持续灭活12小时，期间振摇2次，再经超声裂解4分钟，灭活终止。本专利技术还提供所述的二联灭活疫苗在制备治疗猪圆环病毒2型和/或猪支原体肺炎引起的疾病的药物中的应用。本专利技术提供的用猪肺炎支原体DJ-166株制备的猪支原体肺炎二联灭活疫苗对不同地区流行的强毒株均有很好的保护效果，且与进口疫苗相比在安全性、免疫效力和免疫产生期上无明显差别，达到进口疫苗的质量标准。本专利技术的猪肺炎支原体（Mycoplasmahyopneumoniae）DJ-166株为申请人从山西养猪场35日龄二元杂交病猪肺脏组织分离得到，以江苏省地方标准（DB32/T1461-2009）猪肺炎支原体检测PCR法，设计引物扩增出特异性猪肺炎支原体P36基因片段，经过基因测序后，初步确定为猪肺炎支原体。然后又经多重PCR（猪鼻支原体、猪絮状支原体和猪肺炎支原体）、培养特性、生化特性和血清学特性鉴定，证明为猪肺炎支原体，纯净。菌株在人工合成培养基传8代稳定后，经过3次克隆纯化后制备得到该株猪肺炎支原体。本专利技术的猪肺炎支原体（Mycoplasmahyopneumoniae）DJ-166株申请人已于2011年01月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，简称CGMCC，邮编：100101，保藏编号为：CGMCCNo.4545。本专利技术提供的猪用二联灭活疫苗在预防猪圆环病毒2型和猪支原体肺炎方面表现出显著的技术效果。安全性试验显示，疫苗单剂量、单剂量重复、超剂量接种试验动物后安全，体温、精神状态正常，无任何临床症状；效力试验显示，本专利技术疫苗对猪圆环病毒2型和猪肺炎支原体的强毒攻击有良好的保护作用，可有效的预防猪圆环病毒2型和猪支原体肺炎；免疫持续期试验显示，免疫持续期为6个月，可确保免疫期内对猪提供有效保护。应用本专利技术制品免疫接种动物可一针防两病，减轻免疫接种工作量，减少免疫次数，减少对猪群的应激，避免因频繁免疫所造成的免疫麻痹和免疫失败。附图说明图1所示为制备二联灭活疫苗中的不同佐剂对比试验中不同佐剂疫苗免疫猪血清PCV2抗体效价曲线图。图2所示为制本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪圆环病毒2型、猪支原体肺炎二联灭活疫苗，其含有灭活的猪圆环病毒2型抗原和灭活的猪肺炎支原体（Mycoplasma?hyopneumoniae）抗原以及油佐剂，其中，所述的猪肺炎支原体为DJ?166株，保藏号为CGMCC?No.4545。

【技术特征摘要】
1.一种猪圆环病毒2型、猪支原体肺炎二联灭活疫苗，其含有灭活的猪圆环病毒2型抗原和灭活的猪肺炎支原体（Mycoplasmahyopneumoniae）抗原以及油佐剂，其中，所述的猪肺炎支原体为DJ-166株，保藏号为CGMCCNo.4545，所述的油佐剂为MontanideISA50V2佐剂。2.如权利要求1所述的二联灭活疫苗，其特征在于，所述的灭活的猪肺炎支原体DJ-166株抗原含量不低于109CCU/ml。3.如权利要求1所述的二联灭活疫苗，其特征在于，所述的灭活的猪圆环病毒2型抗原的含量不低于106.5TCID50/ml。4.如权利要求1~3任一项所述的二联灭活疫苗的制备方法，其包括如下步骤：1）分别增殖浓缩猪圆环病毒2型毒液和猪肺炎支原体菌液；2）分别灭活猪圆环病毒2型浓缩毒液和猪肺炎支原体浓缩菌液；3）制备油相：将MontanideISA50V2佐剂装入灭菌瓶内，121℃灭菌30分钟；4）制备水相：用步骤2）的灭活PCV2浓缩毒液稀释步骤2）的灭活Mhyo浓缩菌液，使水相中PCV2抗原含量至少为106.3TCID50/ml、Mhyo抗原含量为300~350µg/ml；5）乳化：将水相成分与油相成分按1:1配比乳化，先将油相加入剪切机内，2000r/min搅拌的同时缓缓加入水相，再以5000r/min搅拌30分钟，终止搅拌前加入1.0%硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01%。5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的猪圆环病毒2型的增殖方法包括如下步骤：1）将猪圆环病毒2型用生长液作1:3稀释，然后按5%（V/V）的比例接种已长满80%-100%单层PK-15A细胞，37℃吸附30分钟，加入细胞维持液37℃培养72小时；...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈硕，王勇，王贵华，车艳杰，赵亚荣，汪竹君，马腾，
申请(专利权)人：北京大北农科技集团股份有限公司动物医学研究中心，北京大北农科技集团股份有限公司，福州大北农生物技术有限公司，北京科牧丰生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：