从胎盘、脐带中提、制同源性间充质干细胞注射剂的方法技术

本发明专利技术提供了一种胎盘间充质干细胞分离和体外扩增培养相结合的方法用以制备胎盘间充质干细胞注射剂；当采用收集胎盘组织细胞后，先进行原代细胞的贴壁扩增，再行正、负向免疫分选结合的方法纯化胎盘间充质干细胞，获得C?D34↑[-]C?D105↑[+]细胞，在无血清体外培养体系中继代扩增培养。本发明专利技术方法每次只需少量原代细胞，就可以达到比较好的分选效果，可进一步提高了胎盘间充质干细胞的纯化率。所用培养体系不但对胎盘间充质干细胞具有明显的扩增优势，并且扩增的细胞具备多分化潜能。可在纯化胎盘间充质干细胞和体外扩增培养中应用。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种从胎盘、脐带中提取和制备同源性间充质干细胞注射剂的方法，包括步骤：采集脐带：待新生儿娩出后，在距新生儿脐部10厘米处用两把止血钳夹住脐带，再从两钳间剪断脐带后结扎，当胎盘完全从母体排出后，从脐带远端消毒，以75％乙醇消毒脐带残端、脐带根部及其周围；待胎盘娩出后，用医用手术缝线或其他适宜的材料结扎胎盘上婴儿端的脐带，用0.9％生理盐水将胎盘脐带涮洗一到两次，以清除胎盘上的羊水及胎粪等污物，避免胎盘脐带与其他物品接触，将采集好的胎盘和脐带放入无菌一次性胎盘采集盒，盖好盒盖，并确认采集液没过胎盘；收集胎盘血造血干细胞：向脐带静脉内注入含有25到50毫升抗凝剂和抗生素的溶液，这抗凝剂可以是肝素，或枸橼酸钠，抗生素是1％的青霉素，链霉素，庆大霉素，也可加制霉菌素，溶液可以是0.9％的生理盐水等渗磷酸缓冲液或DMEM细胞培养液，然后用夹子夹住脐带，竖起脐带一分钟并用手或器械顺着脐带往胎盘处向下捋，让溶液进入胎盘，把整个胎盘无菌的放到采血架，无菌消毒脐带远端，用带有测孔且粗的三通管的特制长针头各刺入二侧远端动脉，后面连着含肝素或枸橼酸抗凝剂或抗菌素的内含250毫升生理盐水的输液袋与输液管和输液泵或注射器相连，将带有采血袋的针头进入脐带静脉，与进入脐带动脉的针头一起固定，之后先打开脐带动脉的开关，让盐水、抗凝剂进入胎盘，一直到看到胎盘充盈，然后打开脐带静脉夹子， 让血液进入采血袋，轻轻压迫胎盘母面，一直到所有胎盘血、盐水和抗凝剂全部进入采血袋，称为胎盘血；收集胎盘组织间充质干细胞：当胎盘进入无菌环境后，采用有机溶剂及生理缓冲液清除胎盘组织和脐带外表的透明质粘液和母血；其中，先采用由酒精、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和碘构成的1号消毒剂清洗胎盘及脐带表面，杀灭任何可能存在胎盘膜和脐带表面上的微生物污染，清除胎盘组织和脐带外表的透明质粘液，在该消毒剂内，酒精浓度为50％到75％以及含有0.1到0.5％的碘和磷酸缓冲液，其pH值为7.2到7.6之间；再采用在1号消毒剂的基础上减去碘的2号有机溶剂清洗胎盘及脐带表面，在该有机溶剂内，含有浓度为50％到75％的酒精和磷酸缓冲液，其pH值为7.2到7.6之间；最后依次采用由酒精和氯化钠构成的3号消毒剂清洁液、磷酸缓冲液(pH7.4)、低分子右旋糖酐及细胞培养液(DMEM)清洗胎盘及脐带表面，其中，在该消毒剂清洁液内，含有浓度为50％到75％的酒精和0.9％氯化钠，其pH值为7.2到7.6之间，在清洗完毕后，剥离胎盘羊膜及绒毛膜，将胎盘组织用手术刀划成米字形；收集胎盘间充质干细胞：采用机械挤压、碾磨及酶的方法和生理缓冲液冲洗的方法，收取含有上皮和胎盘组织间充质干细胞组织液的混合液：该缓冲液可以含有抗菌素，像青霉素(100U/ml)，链霉素(100g/ml)也可含有2500到10,000单位的无防腐剂的肝素；或采用输液器(可以用注射器或输液泵从脐带静脉或脐带动脉注入0.25％胰酶 (Trypsion)，或0.1?1％胶原酶II(Collegenase)，或0.5％Dispense?II酶，也可加入0.05到0.2％的(Ethylene?diamine?tetra?aceticacid)(EDTA)，在37度温箱内孵育含有组织细胞分离酶的胎盘30分钟到90分钟，然后在脐带静脉或脐带动脉内灌注生理缓冲液冲洗，该生理缓冲液的成分可以是生理盐水，低分子右旋糖甘磷酸缓冲液(phosphate?buffered?saline)或细胞培养液，像1640，DMEM(Dulbecco’s?modified?Eagle’s?medium)，每冲洗一次，然后挤压一次，收取含有以间充质干细胞为主的血液和组织液的混合液，再冲洗，挤压3到5次，时间在30到60分钟之间，这样收取的缓冲液的混合物为胎盘组织间充质干细胞，其体积在100到400毫升之间。该缓冲液可以含有抗菌素，像青霉素(100U/ml)，链霉素(100g/ml)也可含有2500到10,000单位的无防腐剂的肝素；收集羊水，胎膜干细胞：从羊水中离心收集干细胞以及从胎盘组织分离羊膜和绒毛膜组织，用生理盐水洗涤后剪碎，采用0.25％的胰酶(Trypsion)或0.1?1％的胶原酶II(Collegenase)，或0.5％Dispense?II酶，或加入0.05到0.2％的(Ethylene?diamine?tetra?acetic?acid)(EDTA)，在37度温箱内孵育或搅拌30到60分钟，收集、过虑、离心获得的细胞为胎膜上皮干细胞；将以上步骤收集到的脐带血、胎盘...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：周胜利，胡当玉，周凝，徐统乐，胡晓辰，
申请(专利权)人：周胜利，
类型：发明
国别省市：