本发明专利技术公开了一种H7N9禽流感病毒二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒。发明专利技术人针对H7亚型禽流感病毒HA基因和N9亚型禽流感病毒NA基因保守序列，分别设计了PCR引物和荧光TaqMan探针，构成专门针对H7亚型和N9亚型禽流感病毒的引物组和探针组，组合成二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，既可确定单个H7亚型或N9亚型禽流感病毒感染，也可一管检测即可确定是否为H7N9禽流感病毒感染，且相互间没有干扰，进一步提高了检测的敏感性和特异性。本发明专利技术及其检测方法充分利用了PCR技术的高扩增性、良好的特异性和荧光检测技术的快速敏感性，反应结束即时便可根据扩增曲线判定是否为H7N9禽流感病毒感染。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于RT-PCR检测试剂盒
，尤其涉及一种H7N9禽流感病毒二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒。
技术介绍
禽流感病毒(Avian Influenza Virus，AIV)属于正粘病毒科A型流感病毒属，为单股负链RNA，多形态的有囊膜病毒。禽流感病毒的基因组分为8个节段，分别编码HA、NA、NP、NS、MP、PA、PB1和PB2蛋白，病毒囊膜上的纤突，分别具有血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的活性。这两个基因是病毒的特异性抗原，根据HA和NA蛋白抗原性不同，目前可分为16个H亚型(H1-H16)和9个N亚型(N1-N9)。由于禽流感病毒其基因组呈节段复制，通过依赖RNA聚合酶完成复制，而RNA聚合酶缺乏校正功能，所以禽流感病毒发生基因突变的频率极高。自2013年2月以来，华东地区上海市、安徽省、江苏省、浙江省先后发生不明原因重症肺炎病例，于3月31日将其确诊为人感染H7N9禽流感病毒。这是首次发现H7N9禽流感病毒感染人的病例，目前，急需建立H7N9禽流感病毒的快速检测方法和研发相应试剂。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种敏感性好、特异性高、快速方便的H7N9禽流感病毒二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒。为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案:H7N9禽流感病毒二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包括引物组和探针组；引物组有引物I至4，它们分别具有序列表SEQ.1D.N0.1至SEQ.1D.N0.4的碱基序列；探针组有探针A和探针B，它们分别具有序列表SEQ.1D.N0.5 至 SEQ.1D.N0.6 的喊基序列。探针A的5’端标记有报告荧光染料FAM，3’端标记有淬灭荧光染料Eclipse ;探针B的5’端标记有报告荧光染料R0X，3’端标记有淬灭荧光染料Eclipse。弓丨物1、引物2、探针A、引物3、引物4和探针B的摩尔比为1:1:2:1:1:1。上述H7N9禽流感病毒二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包括反转录反应液、PCR反应液、DEPC水和超纯水；反转录反应液每管16 μ L,含有5 X Reverse TranscriptaseBuffer 10 μ L、50pmol9mer Random Primer2 μ L>IOmM dNTP Mixture2μ L、40URibonuclease Inhibitorl μ L 和 5U/ μ L AMV Reverse Transcriptasel μ L ；PCR 反应液每管11.4μ L，含有2XPremix Ex TaqlOy L, 20 μ M Η7亚型禽流感病毒正向、反向引物和TaqMan探针分别0.2 μ L、0.2 μ L、0.4 μ L，20 μ M Ν9亚型禽流感病毒正向、反向引物和TaqMan探针各0.2 μ L ；DEPC水和超纯水各lmL。专利技术人针对H7亚型禽流感病毒HA基因和N9亚型禽流感病毒NA基因保守序列，通过Primer Express3.0软件,设计了多套探针和引物,通过分析其特异性和引物之间的二聚体，筛选出了 2套荧 光TaqMan探针和引物，构成专门针对H7亚型和N9亚型禽流感病毒的引物组和探针组，组合成二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，既可确定单个H7亚型或N9亚型禽流感病毒感染，也可一管检测即可确定是否为H7N9禽流感病毒感染，且相互间没有干扰，进一步提高了检测的敏感性和特异性。本专利技术在常规PCR的基础上添加了一条标记两个荧光染料基团的核苷酸探针，报告荧光染料在探针的5’端，淬灭荧光染料标记在探针的3’端，二者构成能量转移结构。当探针完整时，报告荧光染料所发射的荧光可被淬灭荧光染料吸收，在荧光定量RT-PCR反应的退火过程中，探针优先结合到DNA模板上，当引物延伸到探针结合位置时，在DNA聚合酶5’端到3’端的外切酶的作用下，探针被水解，从而导致报告荧光基团和淬灭荧光基团距离变远，报告荧光信号得以释放出来而被仪器检测到，反应结果可以直接通过电脑实时观察，从而实现对H7N9禽流感病毒的快速检测，并根据试验结果判定H7N9禽流感病毒感染，同时还可确定H7亚型禽流感病毒、N9亚型禽流感病毒感染，根据本专利技术建立标准曲线，还可确定待检样品中H7N9禽流感病毒拷贝数。实验证明，一方面，本专利技术及其检测方法充分利用了 PCR技术的高扩增性、良好的特异性和荧光检测技术的快速敏感性，反应结束即时便可根据扩增曲线判定是否为H7N9禽流感病毒感染；另一方面，若非H7N9禽流感病毒感染，还可确定是否是H7亚型禽流感病毒或N9亚型禽流感病毒感染。附图说明图1是应用本专利技术的二重荧光定量RT-PCR的特异性试验(FAM通道)结果图。图2是应用本专利技术的二重荧光定量RT-PCR的特异性试验(R0X通道)结果图。 图3是应用本专利技术的二重荧光定量RT-PCR的敏感性试验(FAM通道)结果图。图4是应用本专利技术的二重荧光定量RT-PCR的敏感性试验(FAM通道)的标准曲线。图5是应用本专利技术的二重荧光定量RT-PCR的敏感性试验(R0X通道)结果图。图6是应用本专利技术的二重荧光定量RT-PCR的敏感性试验(R0X通道)的标准曲线。图7是应用本专利技术的二重荧光定量RT-PCR的重复性试验(FAM通道)结果图。图8是应用本专利技术的二重荧光定量RT-PCR的重复性试验(R0X通道)结果图。具体实施例方式实施例1引物和探针的设计及试剂盒的制备禽流感病毒(H2N3、H4N5、H7N2、H8N4和H10N3) RNA由香港大学惠赠；禽流感病毒(H1N7、H5N1、H11N9) RNA由美国宾夕法尼亚大学惠赠；H7N9禽流感病毒的阳性RNA由广西壮族自治区疫病控制中心惠赠。禽流感病毒(113吧、册邮、!19吧)、新城疫病毒(冊￥)、传染性支气管炎病毒(IBV)和传染性喉气管炎病毒(ILTV)由广西壮族自治区兽医研究所分离保存。1、引物和探针的设计根据基因库中H7亚型禽流感病毒HA基因和N9亚型禽流感病毒NA基因保守序列，进行比对，确定H7亚型禽流感病毒HA基因保守序列(genbank:KC853766.1的第1054-1157位核苷酸)和N9亚型禽流感病毒NA基因保守序列(genbank:KC853765.1的第427-509位核苷酸)，采用Primer Express3.0软件设计引物对及探针，引物序列为:H7 亚型禽流感病毒正向引物(引物 1):5 ’ -GGATGGGAAGGTCTSATTGA-3 ’ (SEQ.ID.N0.1)H7 亚型禽流感病毒反向引物(引物 2 ): 5 ’ -TGATCWATTGCAGATTGGGTGC-3 ’( SEQ.1D.N0.2)H7亚型禽流感病毒TaqMan探针(探针A):5’ -CAAAATGCACAAGGRGARGGAACTGC-3’ (SEQ.1D.N0.5)H7亚型禽流感病毒TaqMan探针的5’端标记有报告荧光染料FAM，3’端标记有淬灭荧光染料Eclipse ；特异性地针对N9亚型禽流感病毒NA 基因保守序列的引物和TaqMan探针的核苷酸序列为:N9 亚型禽流感病毒正向引物(引物 3):5’ -GGAACAATACACGATAGRTCCCA-3’ (SEQ.1D.本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种H7N9禽流感病毒二重荧光定量RT?PCR检测试剂盒，其特征在于包括引物组和探针组；引物组有引物1至4，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.4的碱基序列；探针组有探针A和探针B，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.5至SEQ.ID.No.6的碱基序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：谢芝勋，罗思思，刘加波，庞耀珊，邓显文，谢志勤，谢丽基，范晴，
申请(专利权)人：广西壮族自治区兽医研究所，
类型：发明
国别省市：
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