Line-1基因甲基化定量检测方法技术

本发明专利技术公开了一种Line-1基因甲基化定量检测方法，具有如下步骤：①对待测样本进行处理，得到样本模板；②设计并合成Line-1基因甲基化引物和Line-1基因未甲基化引物；③分别用步骤②的甲基化引物和未甲基化引物对步骤①的样本模板进行PCR扩增反应，并分别得到相应的PCR扩增产物；④对分别对步骤③得到的PCR扩增产物进行处理，并分别得到相应的标准品模板；⑤分别对步骤①的样本模板以及步骤④的标准品模板进行实时荧光定量PCR检测，并计算出甲基化程度。本发明专利技术针对Line-1基因设计出了甲基化引物和未甲基化引物，这样可以利用MSP法和实时荧光定量PCR法对Line-1基因甲基化进行定性定量检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医学
，具体涉及一种。
技术介绍
在肿瘤细胞增殖与分化中，基因突变、DNA甲基化紊乱表达、LOH缺失等是导致癌基因和抑癌基因调控紊乱的主要原因，而DNA甲基化作为非常重要的表观遗传机制，均参与上述调控过程，在肿瘤的形成中发挥潜在作用。基因异常DNA甲基化的检测方法主要有甲基化敏感性限制性内切酶法、重亚硫酸盐测序法(BSP)以及甲基化特异性PCR法(MSP)三种。其中甲基化特异性PCR法是目前研究基因甲基化最为广泛的、首选的方法。但是该方法仍然存在下列缺点:(1)这种方法只能作定性研究，即只能明确是否存在甲基化；若要求定量.则需用其他的方法进行进一步检测；(2)若要区分甲基化引物与非甲基化引物扩增产物量的不同，需要严格控制PCR反应的条件及循环数。而甲基化特异性PCR法最为关键的一点在于引物的设计。Line-1基因是一种分布在人类基因组内的内源性的易变基因序列。研究表明，大约有4 X IO5的Line-1基因重复拷贝存在于人类基因组，它们占据整个人类基因组的5%。在哺乳动物的基因组中，Line-1的反转录活性具有潜在的危险性，而Line-1基因启动子区的CpG岛DNA甲基化可导致其沉默，是一种重要的保护机制。DNA重复序列Line-1的甲基化有利于整个基因组的稳定性和完整性，而Line-1的低甲基化(去甲基化)却增加了基因组的不稳定性和有丝分裂重组的机会。Line-1序列启动子区的低甲基化可导致整个基因组的不稳定。低甲基化导致的Line-1反转录活性激活能够使肿瘤抑制基因失活(例如结肠癌中的APC)，插入癌基因 上游的Line-1启动子序列可以导致这些肿瘤基因的失活(例如乳腺癌中的c-myc基因)。Line-1序列的低甲基化现象出现在多种肿瘤中，包括结肠癌、膀胱上皮癌、恶性生殖细胞瘤、卵巢癌、宫颈癌、神经内分泌肿瘤、前列腺癌、慢性髓样白血病等等。在一项研究中，作者用焦磷酸测序的方法检测了 48例非细胞肺癌中Line-1序列的甲基化状态，结果发现Line-1的低甲基化水平与基因组的不稳定性相关。而在前列腺癌中，Line-1的低甲基化与肿瘤的恶性程度相关。因此，DNA重复序列的Line-1甲基化检测可作为肿瘤基因组整体低甲基化的标记物，研究Line-1序列的甲基化有助于我们对肿瘤发病机理的分子研究。目前尚未发现检测Line-1基因甲基化的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种。实现本专利技术目的的技术方案是:一种，具有如下步骤:①对待测样本进行处理，得到样本模板；②设计并合成Line-1基因甲基化引物和Line-1基因未甲基化引物；③分别用步骤②的甲基化引物和未甲基化引物对步骤①的样本模板进行PCR扩增反应，并分别得到相应的PCR扩增产物；④对分别对步骤③得到的PCR扩增产物进行处理，并分别得到相应的标准品模板分别对步骤①的样本模板以及步骤④的标准品模板进行实时荧光定量PCR检测，并计算出甲基化程度。其中步骤②中所述的Line-1基因甲基化引物如下:Line_l基因甲基化正向引物:CGCGAGTCGAAGTAGGGC ;Line_l 基因甲基化反向引物:ACCCGAITTTCCAAATACGACCG ；扩增片段长度为llObp。步骤②中所述的Line-1基因未甲基化引物如下:Line_l基因未甲基化正向引物:TGTGTGTGAGTTGAAGTAGGGT ;Line_l基因未甲基化反向引物:ACCCAATTTTCCAAATACAACCATCA ;扩增片段长度为 I IObp。上述步骤①中所述的对待测样本进行处理包括:A、从待测样本中提取DNA ;B、对提取的DNA进行亚硫酸氢钠修饰；C、对修饰后的DNA进行纯化，得到样本模板。所述的待测样本包括组织、血液、体液、分泌物或者穿刺物。上述步骤③中所述的PCR扩增反应的反应条件为:95°C预变性5min ;95°C变性30s, 58°C退火 40s, 72°C延伸 45s, 35 个循环。上述步骤③中所述的PCR扩增反应的反应体系为:2.5 μ L 不含 MgCl2 的 IOxPCR buffer ；2.0 μ L 浓度为 25mM 的 MgCl2 ；2.0μ L 浓度为 2.5mM 的 dNTP ；0.5μ L浓度 为 5 υ/μ L 的 Taq 酶；0.5μ L浓度为20μΜ的正向引物；0.5μ L浓度为20μΜ的反向引物；1.0yL的样本模板；16μΙ^3Η20。上述步骤④中所述的对PCR扩增产物进行处理具体过程如下:先将PCR扩增产物进行纯化并连接入PMD18-T Vector ;然后电击法转化至大肠杆菌的DH5 α工程菌；接着挑选出重组克隆菌进行菌液DNA测序；最后对测序正确的重组克隆菌进行扩增、抽提，得到标准品模板。上述步骤⑤中所述的实时荧光定量PCR检测的反应条件为:95°C预变性5min ；95°C变性30s，58°C退火40s，72°C延伸45s，40个循环。上述步骤⑤中所述的PCR扩增反应的反应体系为:10 μ L 的 SYBR-PCR 反应液；0.5μ L的正向引物;0.5μ L的反向引物;1.0yL 的模板；8μΙ^3Η20。上述步骤⑤中所述的甲基化程度的计算方法为:以标准品的拷贝数的对数为横坐标，检测得到的标准品的循环数为纵坐标，分别制作Line-1基因甲基化标准品标准曲线和Line-1基因未甲基化标准品标准曲线；由制作的标准曲线的斜率和截距以及检测得到的待测样本的循环数计算出待测样本的Line-1基因甲基化的拷贝数M和Line-1基因甲基化的拷贝数U ;M/ (M+U)即为Line-1基因甲基化程度的定量值。本专利技术具有的积极效果:本专利技术针对Line-1基因设计出了 Line-1基因甲基化引物和Line-1基因未甲基化引物，这样可以利用甲基化特异性PCR法对Line-1基因甲基化进行定性检测，同时结合实时荧光定量PCR法对Line-1基因甲基化进行定量检测，具有特异性好、灵敏度高、定量精确、快速简便、可重复性高等特点。附图说明图1为本专利技术的Line-1基因甲基化标准品定量PCR检测曲线；其中A为标准曲线，B为融解曲线，C为扩增曲线。图2为本专利技术的Line-1基因未甲基化标准品定量PCR检测曲线；其中A为标准曲线，B为融解曲线，C为扩增曲线。具体实施例方式(实施例1)本实施例以肝癌患者临床组织为待测样本，定量检测Line-1基因的甲基化程度。本实施例的定量检测方法具有以下步骤:①对待测样本进行处理，得到样本模板。A、从待测样本中提取DNA。取新鲜肝癌切除组织50mg，用基因组DNA抽提试剂盒提取DNA (按说明书操作)，得到待测样本的DNA。B、对提取的DNA进行亚硫酸氢钠修饰，具体过程如下: I)、取I μ g的DNA溶于20 μ L的水中，95°C水浴IOmin ;立即放入冰浴；加入2 μ L浓度为IOM的氢氧化钠，使DNA变性，成为单链DNA。2)、加入230 μ L的亚硫酸氢钠修饰液(含有5Μ的亚硫酸氢钠、IOmM的氢醌、ImM的TAC以及0.3Μ的盐酸胍，pH为5.0),混匀后分装到三个PCR管中，每管约80 μ L 90 μ L。3)、将三个PCR管放入PCR仪，运行下列程序进行亚硫酸氢钠修饰反本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种Line?1基因甲基化定量检测方法，具有如下步骤：①对待测样本进行处理，得到样本模板；②设计并合成Line?1基因甲基化引物和Line?1基因未甲基化引物；③分别用步骤②的甲基化引物和未甲基化引物对步骤①的样本模板进行PCR扩增反应，并分别得到相应的PCR扩增产物；④分别对步骤③得到的PCR扩增产物进行处理，并分别得到相应的标准品模板；⑤分别对步骤①的样本模板以及步骤④的标准品模板进行实时荧光定量PCR检测，并计算出甲基化程度；其特征在于：步骤②中所述的Line?1基因甲基化引物如下：Line?1基因甲基化正向引物：CGCGAGTCGAAGTAGGGC；Line?1基因甲基化反向引物：ACCCGATTTTCCAAATACGACCG；扩增片段长度为110bp；步骤②中所述的Line?1基因未甲基化引物如下：Line?1基因未甲基化正向引物：TGTGTGTGAGTTGAAGTAGGGT；Line?1基因未甲基化反向引物：ACCCAATTTTCCAAATACAACCATCA；扩增片段长度为110bp。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张长松，凌扬，朱长太，朱静，刘永萍，孔颖泽，
申请(专利权)人：常州市肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：