本发明专利技术公开了一种靶向CD47阳性白血病细胞的溶瘤腺病毒构建方法及其用途。构建sCAR-4N1的表达框；插入到pXC2-sp-E1A质粒相应酶切位点,获得pXC2-sCAR-4N1-sp-E1A质粒；pXC2质粒删除E1B、插入外源抗癌基因表达框构建得到pXC2-△E1B-gene质粒；然后构建得到pXC2-sCAR-4N1-sp-E1A-△E1B-gene质粒。溶瘤腺病毒Ad.sCAR-4N1-sp-E1A和/或溶瘤腺病毒Ad.sCAR-4N1-sp-E1A-△E1B-gene用于制备抗肿瘤药物。本发明专利技术体内外实验显示对表达CD47的白血病细胞具有较好的杀伤效果。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及溶瘤腺病毒基因治疗领域，尤其是涉及一种靶向CD47阳性白血病细胞的溶瘤腺病毒构建方法及其用途。
技术介绍
白血病是由一系列与细胞生长、分化与死亡相关的众多基因变异所导致的异质性疾病，是造血系统的恶性肿瘤，其发病率在中国为4.17/10万，在肿瘤中居第七位，欧美国家为6.14/10万，居肿瘤的第六位，死亡率居肿瘤的第六位，是严重危害人类身体健康的恶性疾病之一。化疗技术的发展大大提高了白血病患者的总生存期，但复发仍然是白血病治疗面临的一大难题，尤其是老年患者和具有较差预后细胞遗传学的患者。近年来，已有越来越多的临床和实验研究显示，白血病患者体内存在着一群比例极少的白血病干细胞(Leukemia stem cells,LSCs)在启动白血病发生和发展中起着决定性的作用,被认为是白血病耐药和复发的主要根源，只有清除白血病干细胞才有可能根治白血病。白血病干细胞在白血病细胞中所占比例极低，但具有一定的自我更新和分化潜能，在白血病的发生和发展中有着重要作用。基于白血病干细胞的靶向治疗，消灭白血病干细胞，从源头根除白血病复发的可能，有望成为治愈白血病的一个新策略。目前对5型腺病毒(Ad5)的研究已很成熟，因此Ad5成为用于肿瘤基因治疗的主要腺病毒载体。Ad5对细胞的感染高度依赖细胞表面的柯萨奇-腺病毒受体(Coxsakie andadenovirus receptor, CAR),但白血病细胞和近50%的上皮细胞源性的肿瘤细胞表面缺乏CAR，使Ad5难以感染这些细胞。而另一方面，肿瘤细胞又往往高表达一些区别于绝大部分正常细胞的膜蛋白，如急性髓性白血病(Acute myeloid leukemia, AML)及其干细胞(AMLLSC)高表达⑶123、⑶44和⑶47，而大部分正常造血干细胞却不表达这些蛋白。此前，我们利用CD123作为白血病治疗靶点设计了溶瘤腺病毒靶向药物，该溶瘤腺病毒通过白血病细胞表面⑶123感染细胞，在细胞内大量复制，大量表达抗癌基因进而裂解细胞，以此达到靶向治疗的目的(中国专利公开号CN 102747046 A)。然而，白血病是一种异质的血液癌症，AML LSC是一种异质的细胞群体，只针对一种靶点的治疗方式显然难以满足临床上的实际需要，但是目前缺少联合治疗的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于建立一个通过修饰Ad5溶瘤腺病毒的外壳纤维(Fiber)使其经由CD47进入白血病细胞、裂解细胞的系统。该系统基于配体(Ligand)和受体(Rec印tor)特异识别的原理，使Ad5溶瘤腺病毒携带SCAR-4N1融合基因，sCAR (solubleCAR)是CAR的膜外片段，4N1是血小板反应蛋白TSP-1上与⑶47相互作用的区域。溶瘤腺病毒在包装细胞内组装 过程中即表达该融合蛋白，通过sCAR和Fiber的结合组装到溶瘤腺病毒外壳，而4N1部分则能特异识别CD47，因此得到的溶瘤腺病毒可特异感染CD47阳性的白血病细胞。溶瘤腺病毒感染CD47阳性白血病细胞后不但能在靶细胞内复制，还能继续表达SCAR-4N1融合蛋白，完成溶瘤腺病毒外壳的修饰，因此复制出的新病毒能启动对靶细胞的新一轮感染，以达到高感染率。该溶瘤腺病毒可依据具体临床病例单独使用，或者与靶向⑶123的溶瘤腺病毒联合使用，以达到理想的疗效。靶向CD47阳性白血病细胞的溶瘤腺病毒的构建方法，所述方法构建的溶瘤腺病毒携带SCAR-4N1表达框。所述方法构建的溶瘤腺病毒可携带外源抗癌基因表达框。所述的靶向CD47阳性白血病细胞的溶瘤腺病毒的构建方法，它包括以下步骤: 1)构建SCAR-4N1的表达框； 2 )酶切回收SCAR-4N1的表达框，插入到pXC2-sp-E IA质粒相应酶切位点，获得pXC2-sCAR-4Nl-sp-ElA 质粒； 3)pXC2质粒在删除ElB后在原位置引入酶切位点，插入外源抗癌基因表达框构建得到 pXC2- Δ ElB-gene 质粒；通过酶切连接将 pXC2-sCAR-4Nl_sp-ElA质粒上的 sCAR-4Nl_sp片段置换到 PXC2- Δ ElB-gene 质粒上，构建得到 pXC2-sCAR-4Nl_sp-ElA- Δ ElB-gene 质粒; 4)pXC2-sCAR-4Nl-sp-ElA 质粒及 pXC2-sCAR-4Nl_sp-ElA- Δ ElB-gene 质粒分别和PBHGE3骨架质粒共转染包装细胞，在包装细胞内完成溶瘤腺病毒Ad.sCAR-4Nl-sp-ElA和溶瘤腺病毒 Ad.sCAR-4N 1-sp-E IA- Δ ElB-gene 的组装； 5)分离纯化溶瘤腺病毒Ad.sCAR-4Nl-sp-ElA和/或溶瘤腺病毒Ad.sCAR-4N 1-sp-EIA- Δ ElB-gene。所述的溶瘤腺病毒Ad.sCAR-4Nl-sp-ElA和/或溶瘤腺病毒Ad.sCAR-4Nl-sp-ElA- Δ ElB-gene是由肿瘤特异启动子控制复制的条件复制型腺病毒。所述的溶瘤腺病毒Ad.SCAR-4N1-SP-E1A和/或溶瘤腺病毒Ad.sCAR-4Nl-sp-ElA- Δ ElB-gene是通过删除病毒基因获得的条件复制型腺病毒。所述的外源抗癌基因包括IL-24、TRAIL、MnS0D、smac、p53、PPA中的一种或多种。所述的溶瘤腺病毒Ad sCAR-4Nl-sp-ElA和/或溶瘤腺病毒Ad.sCAR-4N 1-sp-E IA- Δ ElB-gene 用于制备抗肿瘤药物。所述的溶瘤腺病毒Ad.sCAR-4Nl-sp-ElA和/或溶瘤腺病毒Ad.sCAR-4Nl-sp-ElA- Δ ElB-gene 与溶瘤腺病毒 Ad-sCAR-1L3_sp-ElA 和 / 或溶瘤腺病毒Ad-sCAR-1L3_sp-ElA- Δ ElB-gene 联合制备抗肿瘤药物。本专利技术具有如下有益效果: (I)根据配体和受体的特异识别设计而成，对表达CD47的白血病细胞具有较好的靶向性。(2) SCAR-4N1融合基因装载在溶瘤腺病毒的基因组，该融合基因可在包装细胞内病毒包装时就得以表达，以非共价的方式修饰到溶瘤腺病毒表面。(3) SCAR-4N1融合基因由于是装载在溶瘤腺病毒的基因组，因此当溶瘤腺病毒感染肿瘤细胞并在细胞内复制时，该融合基因可获表达并修饰到溶瘤腺病毒表面，因此复制出来的新病毒的表面都将组装有SCAR-4N1融合蛋白，可进一步感染更多的CD47+白血病细胞，达到高感染率。(4)构建的溶瘤腺病毒有供抗癌基因插入的位点，抗癌基因随着病毒复制其拷贝数大幅度升高，实现对肿瘤细胞的高效杀伤能力。(5)根据抗癌基因的不同，可形成一系列的Ad.sCAR-4Nl_sp-ElA- Δ ElB-gene,如武装 IL-24 抗癌基因，则形成 Ad.sCAR-4Nl-sp-ElA- Δ E1B-1L24。(6)使用条件复制型溶瘤腺病毒，因此构建的溶瘤腺病毒可在肿瘤细胞内高度复制，却不能在正常细胞内复制，以此实现对正常细胞无毒性或低毒性，达到肿瘤靶向治疗的目的。(7)可进一步使用不同类型的条件复制型溶瘤腺病毒载体，可形成一系列携带SCAR-4N1和抗癌基因表达框的溶瘤腺病毒，以靶向⑶47阳性的白血病细胞。(本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种靶向CD47阳性白血病细胞的溶瘤腺病毒的构建方法，其特征在于，所述方法构建的溶瘤腺病毒携带sCAR?4N1表达框或溶瘤腺病毒携带外源抗癌基因表达框；具体的构建方法包括如下步骤：1）构建sCAR?4N1的表达框；2）酶切回收sCAR?4N1的表达框，插入到pXC2?sp?E1A质粒相应酶切位点,?获得pXC2?sCAR?4N1?sp?E1A质粒；3）?pXC2质粒在删除E1B后在原位置引入酶切位点，插入外源抗癌基因表达框构建得到pXC2?△E1B?gene质粒；通过酶切连接将pXC2?sCAR?4N1?sp?E1A质粒上的sCAR?4N1?sp片段置换到pXC2?△E1B?gene质粒上，构建得到pXC2?sCAR?4N1?sp?E1A?△E1B?gene质粒；4）pXC2?sCAR?4N1?sp?E1A质粒及pXC2?sCAR?4N1?sp?E1A?△E1B?gene质粒分别和pBHGE3骨架质粒共转染包装细胞，在包装细胞内完成溶瘤腺病毒Ad.sCAR?4N1?sp?E1A和溶瘤腺病毒Ad.sCAR?4N1?sp?E1A?△E1B?gene的组装；5）分离纯化溶瘤腺病毒Ad.sCAR?4N1?sp?E1A和/或溶瘤腺病毒Ad.sCAR?4N1?sp?E1A?△E1B?gene。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李恭楚，武虎，陈磊，梁天祥，
申请(专利权)人：浙江理工大学，
类型：发明
国别省市：
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