本发明专利技术涉及一种液泡膜定位序列及其应用。本发明专利技术人首次分离到一段细胞液泡膜专一性定位的信号序列(Tonoplast?Targeting?Sequence，TTS)，该序列可引导蛋白精确高效地定位于细胞内液泡膜上。利用该序列可进行目的蛋白的定位改造，减少或阻止目的蛋白表达于液泡膜以外的其它部位。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物技术以及植物学领域；更具体地，本专利技术涉及一种液泡膜定位序列及其应用。
技术介绍
细胞是各种生命形式的基本组成单位，形形色色的蛋白质根据其自身的特性有序地分布在细胞的每个分区中行使相应的生物学功能(Cavalier-Smith，2009)。植物细胞的主要分区包括质膜和其它内膜系统、细胞核、细胞质以及位于其中的线粒体、叶绿体、高尔基体、内质网、核糖体、过氧化物酶体、液泡等各种细胞器。这些构成细胞的微小结构或分区统称为亚细胞结构。在植物细胞中，每个亚细胞结构上都分布着多种具有生物活性的蛋白质。蛋白质亚细胞定位的研究对于系统地理解植物形态建成、生长发育以及对环境的适应等方面都是必不可少的环节，不仅已成为功能基因组学的重要研究内容，而且具有生物工程上的实际应用价值。植物中各种蛋白质都是依据其自身基因编码的氨基酸序列所包含的定位信息，通过各种精确的分子机制定位到细胞特定的亚细胞部位的。人们通过各种定位技术，对各亚细胞结构中蛋白质的分布情况了解的越来越多。质膜和细胞内膜是一个蛋白质种类较多的区域，膜上的蛋白质主要有载体蛋白、通道蛋白、离子转运蛋白和蛋白受体等，还分布着一些重要的酶以及某些植物逆境相关蛋白；细胞质中分布着各种代谢活动所需的相关酶类；线粒体是有氧呼吸的主要场所，主要含有与有氧呼吸相关的酶类；叶绿体是植物光合作用的场所，因此也是光合作用所需酶类的主要存在部位；细胞核中也含有种类繁多的蛋白质，包括控制遗传信息合成、复制、代谢的酶与一些核定位信号相关的蛋白质坐寸ο液泡是细胞质中由单层膜包围的充满水溶液的泡状结构，是植物细胞中普遍存在并具有多种功能的重要 细胞器(Wink M(1993)The plant vacuole:a multifunctioncompartment.J Exp Bot 44:231-246)。大部分植物细胞没有液泡就难以存活。植物液泡的形成起源于内质网-高尔基体-反式高尔基网络等内膜系统，通过生物合成、分泌途径的运输以及自体吞噬形成植物细胞特有的中央大液泡(Zouhar J, Rojo E(2009)Plantvacuoles:where did they come from and where are they heading Curr Opin PlantBiol 12:677-684)。随着细胞生物学与分子生物学研究的深入，人们逐渐认识到液泡不仅仅是简单的物料储藏室或者蛋白降解库，它参与调节细胞代谢与生长发育，控制细胞内物质累积和运输，维持细胞内环境稳定性，并提高植物适应环境变化和的生命活力。一般认为蛋白质在内质网上加工后通过分泌与内吞途径(secretory and endocytic pathways)运输到液泡内。在分泌途径的早期，高尔基体的分泌出芽点就已经将定位于液泡中的可溶性蛋白和膜蛋白与即将运送到细胞表面的蛋白质区分开来。液泡可溶性蛋白需要一类特殊的定位信号(vacuolar sorting determinant, VSD)加以标记，以便离开高尔基体后被相应的分拣受体蛋白VSR或类受体蛋白RMR等受体识别，从而顺利地向液泡进行运输。液泡分拣信号VSD主要包括序列特异性信号(ssVSD)、C-末端定位信号(CtVSD)和结构定位信号(psVSD)这三种类型。它们可以单独或者共同起作用。例如，在大豆IlS球蛋白中，多种VSD共同决定了它液泡定位的特性。尽管目前人们对蛋白的液泡定位机制有一定的认识，然而目前对于液泡膜上蛋白的亚细胞定位决定因子的研究非常缺乏，国际上也罕有相关报道。液泡膜具有较为复杂的结构，其上的蛋白数量也很多，在拟南芥蛋白质组的研究中鉴定出有195种不同的蛋白整合在液泡膜上(Carter C, Pan S, Zouhar J, Avila EL, Girke T,Raikhel NV(2004)The vegetative vacuole proteome of Arabidopsis thaliana revealspredicted and unexpected proteins.Plant Cell 16:3285-3303)。液泡膜上的蛋白不仅参与膜电位平衡与渗透调节，还负责运输储存营养元素，调控代谢过程并参与细胞的信号转导。本领域目前尚未有报道表明在植物中分离到决定液泡膜定位的专一性信号序列。因此，迫切需要找到一种液泡膜的专一性信号序列，以填补本领域的空白。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种液泡膜定位序列及其应用。在本专利技术的第一方面，提供一种分离的多肽(液泡膜定位多肽)，其是:(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的多肽；(b)氨基酸序列如SEQ ID NO:3中第I (20-50)位所示的多肽；(c)氨基酸序列如SEQ ID NO:5中第I (20-50)位所示的多肽；(d)将(a)多肽经过一个或多个(如1-5个；较佳地1-4个；更佳地1_3个；更佳地1-2个)氨基酸残基的取代或添加而形成的，且具有液泡膜定位功能的多肽；(e)将(b)或 (C)多肽经过一个或多个(如1-5个；较佳地1-4个；更佳地1_3个；更佳地1-2个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有液泡膜定位功能的多肽；或(f)与(a)或(b)或(C)多肽的氨基酸序列相同性高于50% (较佳地高于60%;更佳地高于70% ;更佳地高于80% ;更佳地高于90% ;更佳地高于95% ;更佳地高于99% )，且具有液泡膜定位功能的多肽。在一个优选例中，(b)中，所述的多肽是氨基酸序列如SEQ ID NO:3中第I (20-28)位(如第1-21位，第1-22位，第1-23位，第1-24位，第1-25位，第1-26位，第1-27位)所示的多肽；或(c)中，所述的多肽是氨基酸序列如SEQ ID NO:5中第I (20-28)位(如第1-21位，第1-22位,第1_23位,第1_24位,第1_25位,第1_26位,第1_27位)所不的多妝。在本专利技术的另一方面，提供一种分离的多核苷酸(液泡膜定位核酸)，其编码所述的多肽。在一个优选例中，所述的多核苷酸具有SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6中第I (57-150)位所示的核苷酸序列。在本专利技术的另一方面，提供所述的多肽的用途，用于引导目的蛋白定位到细胞的液泡膜(即:用于目标蛋白的液泡膜亚细胞定位)。在一个优选例中，所述的多肽用于减少或防止目的蛋白表达于细胞的液泡膜以外的其它部位(包括细胞器)。在本专利技术的另一方面，提供一种表达构建物，其中含有所述的多核苷酸。在一个优选例中，所述的表达构建物不含有全长的编码SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:5的多核苷酸。在另一优选例中，所述的表达构建物中，所述的多核苷酸(液泡膜定位核酸)的5'端和/或3'端，还包括多克隆位点(限制性内切酶位点)，用于连接编码目的蛋白的多核苷酸。在另一优选例中，所述的表达构建物中还含有与所述的多核苷酸操作性连接的编码目的蛋白的多核苷酸。在另一优选例中，所述的目的蛋白是外源蛋白。在另一优选例中，所述的目的蛋白是可溶性蛋白。在另一优选例中，所述的目的蛋白是结构蛋白、调控蛋白、转录因子等任何需要定位于液本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分离的多肽，其是：(a)氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1或SEQ?ID?NO：2所示的多肽；(b)氨基酸序列如SEQ?ID?NO：3中第1～(20?50)位所示的多肽；(c)氨基酸序列如SEQ?ID?NO：5中第1～(20?50)位所示的多肽；(d)将(a)多肽经过一个或多个氨基酸残基的取代或添加而形成的，且具有液泡膜定位功能的多肽；(e)将(b)或(c)多肽经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有液泡膜定位功能的多肽；或(f)与(a)或(b)或(c)多肽的氨基酸序列相同性高于50％，且具有液泡膜定位功能的多肽。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张洪霞，唐仁杰，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：
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