利用聚酮合酶生产α-烯烃制造技术

本发明专利技术提供了能合成α-烯烃如1-己烯或丁二烯的聚酮合酶(PKS)。本发明专利技术还提供了包含PKS且在培养时能够产生α-烯烃的宿主细胞。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及利用聚酮合酶产生α -烯烃，因而涉及化学、微生物学和分子生物学领域。
技术介绍
I型聚酮合酶(PKS)是能够具有脂肪酸合酶(FAS)的所有催化能力的可编程的多功能酶。然而，与FAS酶反复延伸并完全还原每次延伸烃主链所产生的β-羰基不同，PKS系统每次延伸和还原新生链时利用分散排列的酶促结构域。这些通常被称为模块的排列能够引入导致不同侧链的多种延伸单元。它们还能够编码O至3个与FAS相关的还原结构域，其在生长的聚酮链的β位分别导致酮基、羟基、双键或完全饱和的碳(Hopwood andSherman.1990.Annual Review of Genetics24:37-66)。由于其模块性，PKS系统已被广泛开发用于产生“非天然的”天然产物(Weissmanand Leadlay.2005.Nature Reviews Microbiology3:925-936)。已经产生数百种这样的分子，范围从碱性内酯到修饰形式的药物和药物样化合物。专利技术概述本专利技术提供了能够合成α-烯烃的聚酮合酶(PKS)，用于产生所述聚酮合酶的重组表达载体，表达所述聚酮合酶并产生期望的α-烯烃的重组宿主细胞，制备α-烯烃的方法以及通过所述方法产生的α-烯烃。本专利技术的PKS不是天然存在的，因而被称为“重组的’TKS酶。在本专利技术的一些实施方案中，α-烯烃不是由天然存在的PKS合成的化合物。在本专利技术的一些实施方案中，PKS是包含来自两种、三种、四种或更多种天然存在的PKS的模块和/或其一部分的杂合PKS。杂合PKS可以含有来自两种或更多种天然存在的PKS的天然存在的模块和/或其可以含有一个或多个模块，所述模块由来自同一种天然存在的PKS或来自两种或更多种天然存在的PKS或以上两种情况的两个或更多个模块的一部分(包括完整的结构域)组成。在本专利技术的一些实施方案中，利用包含天然存在的或重组的CurM模块或其一部分的重组核酸。本专利技术提供了编码本专利技术PKS的重组核酸。重组核酸包括以下核酸:包含本专利技术的一部分或全部PKS的核酸，还包含调控序列如启动子和翻译起始和终止序列的核酸，以及还可包含促进在宿主细胞中稳定维持的序列(即，提供复制起始功能的序列或促进通过同源重组整合入宿主细胞染 色体DNA或其它DNA中的序列)的核酸。在一些实施方案中，重组核酸被稳定地整合入宿主细胞的染色体。在一些实施方案中，重组核酸是质粒。因此，本专利技术还提供了包含本专利技术重组核酸的载体，包括表达载体。本专利技术还提供了包含本专利技术的重组核酸和/或PKS中的任一种的宿主细胞。在一些实施方案中，当在合适的条件下培养时，宿主细胞能够产生α-烯烃。这些宿主细胞包括，例如但不限于原核生物以及真核生物，所述原核生物如肠杆菌(Ε.coli)、芽孢杆菌(Bacillus)属、链霉菌(Streptomyces)属、粘细菌(Myxobacterial)属,所述真核生物包括但不限于酵母和真菌菌株。因此，本专利技术提供了包含本专利技术的一种或多种重组核酸和/或PKS的多种宿主细胞。在一些实施方案中，当培养时，宿主细胞能够产生α-烯烃，在不存在本专利技术核酸的条件下，α-烯烃不会产生或以较低的水平产生。本专利技术提供了产生α -烯烃的方法，所述方法大体包括:提供本专利技术的宿主细胞，在合适的条件下，在合适的培养基中培养所述宿主细胞，使其产生α -烯烃。本专利技术还提供了组合物，所述组合物包含来自宿主细胞(其产生α-烯烃)的α -烯烃，并且在一些实施方案中，可以包含宿主细胞的痕量残留物和/或其它成分。这类痕量残留物和/或其它成分可以包括，例如，由宿主细胞裂解所产生的细胞物质。本专利技术还提供了纯化α-烯烃的方 法以及将所述α-烯烃转化成其它有用的产物的方法。附图说明本领域技术人员由以下详细描述的示例性实施方案结合附图阅读时，将易于理解本专利技术的以上方面和实施方案以及其它方面。图1显示了根据本专利技术适于合成1-己烯的生物合成途径的模块构建的示例性实例。在该图中，推荐的模块来源于来自红霉素PKS的DEBSl的装载模块，来自制霉菌素PKSNysC的模块5和curacin PKS的CurM末端模块。在本专利技术的另一实施方案中，制霉菌素PKS模块5用来自茚满霉素(indanomyCin)PKS的模块9和10的一部分替代。这种可选择的实施方案实际上已用于产生1-己烯。图2显示了所用的模块类型和用于引入聚酮链的对应前体。装载模块被命名为S。尽管可以使用任何合适的装载结构域(诸如装载醋酸盐和苯甲酸的那些结构域)，但在该图中仅示出了两个实例。其余化合物代表利用延伸模块A - P引入生长的聚酮链中的结构。虚线指示通过克莱森(Claisen)缩合反应形成的C-C键；键右侧的原子和虚线左侧的C原子代表由所用模块决定的结构。R基代表在由模块决定引入之前已存在的酰基链。图3显示:㈧根据本专利技术可用于产生1-己烯的PKS系统，⑶可如何添加其它模块以产生更长的偶数链α-烯烃，以及(C)根据本专利技术的方法，如何改变引入醋酸盐(来自丙二酰辅酶Α)的装载模块来允许达到饱和的线性奇数链α-烯烃。图4显示了图解利用除虫菌素PKS装载模块的本专利技术的一实施方案。所示的侧链仅仅是实例，而并非构成可利用除虫菌素装载模块(或相似的装载模块)根据本专利技术的方法和教导引入的整个侧链库。图5在(A)部分中显示了 3-亚甲基-4-戊烯酸的示例性途径的实例，根据本专利技术的方法利用PKS获取羧化丁二烯衍生物的实例，以及二烯烃和羧酸部分之间的距离可如何通过使用其它PKS模块来增加。图5在(B)部分中显示了从jamaicamide途径生物合成环外亚甲基所提出的机制(参见Edwards et al.2004.Chem Biol.11 (6):817-33;通过引用并入本文)。图6显示了根据本专利技术的方法产生丁二烯的PKS。尽管本专利技术不以任何方式受本文列举的或显示的任何所提出的作用机制的限制，但是该图为了简单的目的示例了羟基以水分子脱除，酶促机制利用硫酸盐作为离去基团。图7显示了根据本专利技术的方法产生丁二烯的PKS。(A)和⑶部分显示了利用修饰成接受丙烯酰辅酶A的DEBS丙酰辅酶A特异性装载结构域装载丙烯酰辅酶A。(C)部分显示了丙烯酸盐部分的硫转移至KS结构域。(D)部分显示了丙二酰辅酶A的结合并转移至ACP结构域。(E)部分显示了 KS催化部分的缩合并释放C02。(F)部分显示了 KR催化β_羰基基团的还原。(G)部分显示了终步骤以及丁二烯、CO2和水的释放(如图6，用水分子示例羟基基团的脱除，但是酶促机制利用硫酸盐作为离去基团)。图8显示了通过本专利技术的方法和材料产生丙烯酰辅酶A可获得的酶促途径，包括外源供给丙酸盐，并表达PrpE和酰基辅酶A脱氢酶活性。为包含该系统的宿主细胞提供丙酸盐，如果丙酸盐不是由所选择用于生产的宿主细胞内源产生的，则可以外源供给。图9显示了通过本专利技术的方法和材料产生丙烯酰辅酶A可获得的酶促途径，包括外源供给丙酸盐和葡萄糖。为包含该系统的宿主细胞提供丙酸盐和宿主细胞可以直接或间接转化成丙酮酸盐的合适的有机分子，所述丙酸盐通过外源供给或上文所述的丙酸盐生物合成途径引入。例如，如果宿主细胞是大肠杆菌，合适的有机分子可以是葡萄糖。该途径利用中心代谢的中间体丙酮酸盐通过乳酸脱氢酶产生本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：杰弗里·L·福特曼，伦纳德·卡兹，艾里克·J·斯蒂恩，杰伊·D·基斯灵，
申请(专利权)人：加利福尼亚大学董事会，
类型：
国别省市：