抗HBV的化合物的筛选方法技术

本发明专利技术涉及一种抗HBV的化合物的筛选方法，其中，该方法以HBV核心蛋白C末端氨基酸序列为药物作用靶点来筛选抗HBV的化合物，所述HBV核心蛋白C末端氨基酸序列至少包含STLPETTVVRRRDRGR。本发明专利技术提供的筛选化合物的方法可用于筛选和发现诱导HBV核心颗粒的异常包装的抗HBV复制活性化合物，而且，还可以用于检测以其它方式获得的针对这些靶位点的用于治疗乙型病毒性肝炎的新型抗病毒药物的活性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学与生物医药
，具体而言，本专利技术涉及以乙型肝炎病毒(HBV)核心蛋白C末端氨基酸序列为药物作用靶位点的药物筛选方法。
技术介绍
慢性乙型病毒性肝炎感染是严重危害人类健康的全球性感染疾病。在中国，乙型肝炎病毒引起的肝脏疾病位列全国十大死因之一，严重影响了人们正常的工作和生活。目前，上市的小分子抗乙型肝炎病毒药物主要为核苷类药物，如拉米夫定、恩替卡韦等，尽管这些药物在抑制病毒复制上都卓有成效，但由于现有核苷类抗乙型肝炎病毒药物的作用靶点单一(HBV DNA聚合酶)，长期使用存在的耐药突变等问题。因此，寻找不同于核苷类抗HBV药物作用机制的新靶点，研发治疗乙型病毒性肝炎新型药物，尤其是非核苷类小分子抗HBV药物，是重要和紧迫的任务。已报道的非核苷类小分子抗HBV活性化合物有:异芳香二氢嘧啶(HAP)系列化合物，代表性化合物BAY38-7690，它同核心蛋白的113-143位氨基酸残基作用而干扰核心蛋白的组装过程，导致核心蛋白单体在细胞内过度累积而被降解；疏水性荧光探针bis-ANS能与核心蛋白结合，使之形成非壳体化的大分子多聚体，误导核心蛋白的正常装配过程，造成病毒基因组复制缺陷；苯丙烯酰胺类化合物AT-61和AT-130能够促进核心蛋白的组装速率，使得PgRNA来不及被包装，从而使得HBV-DNA复制水平降低；塞菊芋黄素同系化合物8-1能特异性地干扰宿主细胞的核转录因子与HBV启动子的相互作用，下调病毒RNA的转录水平。HBV核心蛋白C末端共计34个氨基酸，为鱼精蛋白样结构，其中有16个精氨酸，形成有3个SPRRR序列与4个精氨酸聚集区，为高碱性末端，可结合前基因组RNA与聚合酶复合物(PgRNA-Pol)启动核壳体包 装。目前尚未见有报道将核心蛋白C末端氨基酸作为药物作用靶点进行抗HBV药物的筛选。重组DNA技术是分子生物学中常用的一种生物技术，是指将一种生物体(供体)的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体(受体)内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。本专利技术通过重组DNA技术构建多种真核表达质粒来表达C末端缺失、截短或突变的核心蛋白，确定核心蛋白C末端4个带正电荷的精氨酸富集区域(RRRDRGR、SPRRR、SPRRRR和SPRRRR)为关键靶点，以此筛选的化合物能有效的诱导形成空载病毒颗粒，从而抑制病毒复制。
技术实现思路
针对现有技术中的不足，本专利技术人进行了广泛深入的研究，并最终完成了本专利技术。本专利技术的目的是提供一种抗HBV的化合物的筛选方法。根据本专利技术的目的，本专利技术提供了一种抗HBV的化合物的筛选方法，其中，该方法以HBV核心蛋白C末端氨基酸序列为药物作用靶点来筛选抗HBV的化合物，所述HBV核心蛋白C末端氨基酸序列至少包含STLPETTVVRRRDRGR。本专利技术中，优选地，所述HBV核心蛋白C末端氨基酸序列可为:STLPETTVVRRRDRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQC、STLPETTVVRRRDRGRSPRRRTPSPRRRRSQ、 STLPETTVVRRRDRGRSPRRRTP 或STLPETTVVRRRDRGRo具体地，所述方法包括以下步骤:(a)通过PCR的方法构建含有HBV核心蛋白C末端氨基酸序列的真核表达质粒，其中，所述HBV核心蛋白C末端氨基酸序列至少包含STLPETTVVRRRDRGR。(b)用步骤(a)中所得质粒瞬时转染肝癌细胞(Huh7细胞，HepG2细胞等细胞系，优选为Huh7细胞)4 6小时后给予筛选化合物处理48 96小时。(c)药物处理后收集细胞，以非变性琼脂糖凝胶电泳来筛选可诱导异常空载HBV核心颗粒包装的化合物。本专利技术中，优选地，所述步骤(b)中筛选化合物处理为:将转染的肝癌细胞或与筛选化合物共同培养，所述化合物的浓度可以根据需要而进行设定。所述步骤(C)具体为:经筛选化合物处理后收集细胞，取细胞裂解液上样于1.8%琼脂糖凝胶孔中，4°C电泳2 3小时，优选为2.5小时。电泳结束后，虹吸法转膜过夜。所得样品可转移至硝酸纤维素膜上，采用与蛋白质印迹法(Western blot)相似的方法，用抗HBc抗体(Abcam)检测由筛选化合物诱导产生的异常核心颗粒。所述异常核心颗粒是指不含HBV病毒遗传物质(病毒核酸)的空载HBV核心颗粒，可阻碍HBV病毒的进一步感染复制。本专利技术提供的筛选化合物的方法可用于筛选和发现诱导HBV核心颗粒的异常包装的抗HBV复制活性化合物，以期发现化合物作用于HBV核心蛋白C末端靶序列，诱导核心蛋白组装成为不含HBV病毒遗传物质(病毒核酸)的空载HBV核心颗粒，从而阻碍HBV病毒的进一步感染复制。而且，本专利技术提供的化合物的筛选方法还可以用于检测以其它方式获得的针对这些靶位点的用于治疗乙型病毒性肝炎的新型抗病毒药物的活性。相对于已有的技术，本专利技术提供的筛选方法的特异性针对性更强，并且(例如与IfepG2.2.15细胞系相比)更有利于抗病毒药物靶点的确定。附图说明图1是根据本专利技术的实施例1中构建的质粒转染Huh7细胞(实施例6)，而得到的核心颗粒凝胶电泳图。图2是根据本专利技术的实施例2中构建的质粒转染Huh7细胞(实施例6)，而得到的核心颗粒凝胶电泳图。图3是根据本专利技术的实施例3中构建的质粒转染Huh7细胞(实施例6)，而得到的核心颗粒凝胶电泳图。图4是根据本专利技术的实施例4和5中构建的质粒转染Huh7细胞(实施例6)而得到的核心颗粒凝胶电泳图。图5是根据本专利技术的实施例7得到的核心颗粒凝胶电泳图。图6是根 据本专利技术的实施例8得到的HBV DNA凝胶电泳图。图7是根据本专利技术的实施例9得到的实时荧光定量PCR结果图。图8是根据本专利技术的实施例10得到的实时荧光定量PCR结果图。图9是根据本专利技术的实施例1的PCR反应程序的图。图10是根据本专利技术的实施例2的PCR反应程序的图。图11是根据本专利技术的实施例9的PCR反应程序的图。具体实施例方式以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本专利技术，但不以任何形式限制本专利技术。实施例1:构建针对靶序列HBc-1的全 长HBV核心蛋白真核表达质粒pHBcl85以表达1.3倍全长HBV基因组(adw亚型)pHBVl.3为模板，克隆编码全长核心蛋白的DNA片段和pcDNA3.1质粒(购自Invitrogen)重组,转化到E.coli受体菌DH5a (购自天根生化科技有限公司)中，经筛选和鉴定，得到了全长核心蛋白的真核表达质粒pHBcl85。扩增引物如下:SP/HBc I Pstl (SEQ ID NO:6)5’ -TTTTCTGCAGATGGACATTGACCCGTATAAAGAATTTGGAGC-3’，ASP/HBc 185 Pst I(SEQ ID NO:7)5’ -TTTTCTGCAGCTAACATTGAGATTCCCGAGATTTAGATCTTCTGCGACG-3’。PCR反应程序如图9所示。转化条件如下:4 °C, 30min42°C, 90s4 °C, 5min质粒PHBcl85可在真核细胞中表达全长的HBV核心蛋白，其C末端包括四个精氨酸富集区，其中三个为SPRRR重复序列，序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗HBV的化合物的筛选方法，其中，该方法以HBV核心蛋白C末端氨基酸序列为药物作用靶点来筛选抗HBV的化合物，所述HBV核心蛋白C末端氨基酸序列至少包含STLPETTVVRRRDRGR。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：左建平，南发俊，杨莉，童贤昆，张仰明，王桂凤，唐炜，
申请(专利权)人：中国科学院上海药物研究所，
类型：发明
国别省市：