本发明专利技术公开了一种验证黄牛CIDEC基因SNPs位点遗传效应的方法，以包含CIDEC基因的黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛CIDEC基因不同单倍型；用限制性内切酶KpnI和XhoI分别消化PCR扩增产物和pGL3-Basic空载体后，再使用DNA连接酶将不同单倍型连接到pGL3-Basic载体上，构建pGL3-Basic-CIDEC-H1、H2、H3、H4、H8、H9表达载体，将构建成功的表达载体转染至3T3-L1细胞中，使用双荧光报告系统试剂盒检测不同单倍型的转录活性。综合不同单倍型的转录活性，以及SNP位点改变顺式作用元件的信息来验证关联分析结果。本发明专利技术提供的检测方法为验证CIDEC基因的单核苷酸多态性遗传效应奠定了基础，以便用于中国黄牛肉用生长性状的标记辅助选择（MAS），快速建立遗传资源优良的黄牛种群。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子遗传学领域，涉及基因单核苷酸多态性(SNP)位点遗传效应的验证方法与应用，特别涉及一种验证黄牛CIDEC基因单核苷酸多态性位点遗传效应的验证方法。
技术介绍
SNP是基因组上的单个核苷酸的变异所形成的遗传标记，基因组上的SNP数量多，而且多态性丰富。据研究SNP在基因组中分别相当广泛，人类基因组中每300个碱基对就出现一次。SNP可以分为单个核苷酸的置换、颠换、缺失和插入。从对生物的遗传性状的影响的分子机制上来看，SNP又可分为2种:一种是同义cSNP (synonymousc SNP),即SNP所致的编码序列的改变并不影响其所翻译的蛋白质的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的含义相同；另一种是非同义cSNP(non-synonymousc SNP),指碱基序列的改变可使以其为蓝本翻译的蛋白质序列发生改变，从而影响了蛋白质的功能，这种改变常是导致生物性状改变的直接原因，cSNP中约有一半为非同义cSNP。错义SNP功能分析的一个重要问题是预测一个特定的错义SNP是否是有害的，一般采用一系列离散或连续的特征来构造预测模型，包括SNP位点的氨基酸物理和化学特征，SNP位点和附近区域的序列保守性，蛋白质结构特征，进化特征等，这些特征可大致分为基于序列的和基于结构的。同义SNP虽然不改变基因编码的蛋白质序列，但其也具有重要的作用，特别在影响基因外显子剪切方面。按照SNP在基因组上的位置不同又可以将SNP分为以下几类:大约有95%的SNP位于非编码区，其中有一小部分位于基因调控区的SNP位点成为调控SNP (rSNP);而存在于基因编码区的SNP位点称为编码SNP (cSNP).目前对编码区SNP研究比较多，对于非编码区的SNP，虽然其功能研究意义重大，但是该区域的SNP数据难以收集，所以没有得到和编码区SNP的研究那样的重视。而本专利以CIDEC基 因为例提供了一种新的验证位于非编码区SNP遗传效应的思路。CIDEC基因属于CIDE家族，该家族成员还有CIDEA和CIDEB。该家族成员序列有高度同源性，它们都包含一个CIDE氮端结构域和一个CIDE碳端结构域。以前的研究结果认为CIDE家族成员与胰岛素诱导的细胞凋亡有关，近些年来很多研究证明CIDE家族也参与了很多重要代谢过程的调控，例如肥胖。尤其是CIDEC基因，在小鼠上该基因也叫脂肪特异蛋白27 (Fsp27)，该基因对于单房性脂滴的形成和白色脂肪组织的能量储存非常重要。Fsp27敲除小鼠表现出由于高能量消耗引起的消瘦体型，同时这些小鼠还表现出抵抗饮食诱导性肥胖和胰岛素抵抗。一个女性患者CIDEC基因碳端的突变导致其患有脂肪代谢障碍综合症。从这些研究可以推测出CIDEC基因可能对牛的脂肪代谢也很重要，尤其是对牛肉的肌间脂肪沉积有重要作用。我们经过试验也验证了这个推测，我们在牛CIDEC基因5端调控区发现了 10个SNP突变位点，这10个多态位点在213头的南阳牛群体中共形成了 9种单倍型，经与南阳牛体重和日增重进行关联分析发现，不同单倍型与南阳牛18月龄体重和日增重显著相关，差异极显著。本专利描述了一种验证CIDEC基因5端SNP位点遗传效应的新思路，以便促进中国黄牛肉用生长性状的标记辅助选择(MAS)，快速建立遗传资源优良的黄牛种群。
技术实现思路
本专利技术解决的问题在于通过CIDEC基因不同单倍型所显示的不同活性来验证它们与黄牛生长性状的关联分析结果，进一步验证其是否可以作为黄牛分子育种中辅助选择的分子标记，从而加快良种选育速度。本专利技术是通过以下技术方案来实现:黄牛CIDEC 基因(AC_000179.1) 5 端调控区有十处 SNP 位点:g.-501G>A;-546T>C;-643T>G; -714T>C; -727C>T; -762C>T; -763C>T; _841T>C; _956G>A; -974C>T,这十处 SNP 位点在南阳牛群体中共形成了 9种单倍型，其中单倍型5，6，7频率过低，所以在转录活性分析中只分析了单倍型1，2，3，4，8，9六种。黄牛CIDEC基因不同单倍型转录活性的检测方法包括以下步骤:(I)、以包含CIDEC基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，使用引物P来扩增黄牛CIDEC基因不同单倍型；(2)、对步骤(I)的扩增产物进行PCR产物的切胶回收及纯化；(3)用限制性内切酶KpnI和XhoI分别消化步骤(2)的纯化产物和荧光素酶报告基因载体pGL3_Basic质粒；(4)步骤(3)中的消化产物经切胶回收及纯化；`(5)使用T4DNA连接酶将步骤(4)中的纯化产物进行连接；(6)将步骤(5)中的连接产物转化ToplO大肠杆菌感受态细胞中，挑取的单克隆通过菌液PCR、双酶切鉴定以及测序三重验证；(7)将步骤(6)中连接正确的质粒转入3T3-L1前脂肪细胞系中，48小时以后使用双荧光报告系统试剂盒测定不同单倍型的转录活性；(8)将步骤(7)中的不同单倍型转录活性与其与生产性状的关联分析结果进行比对，达到验证关联分析结果的目的。(9)将包含十个突变序列的相应CIDEC片段输入Genomatix数据库(http://www.genomatix.de),搜索识别序列包含或临近这十个突变位点的顺式作用元件。从顺式作用元件与其对应的转录因子水平解释关联分析结果。如上述技术方案所述的黄牛CIDEC基因不同单倍型转录活性的检测方法，其中，步骤(I)所述的引物对P为:上游引物:cggggtacctgggaacaggagaacatttcag 3Ibp ；下游引物:ccgctcgagacaagatgccaaggtgacttaca 32bp0所述的PCR扩增反应程序为:94°C预变性 5min ;30 个循环 94°C变性 30s，65°C退火 30s，72°C延伸 60s ;72°C延伸lOmin。如上述技术方案所述的黄牛CIDEC基因不同单倍型转录活性的检测方法，其中，步骤(2)、(4)所述的琼脂糖凝胶的质量浓度为1.5%。如上述技术方案所述的黄牛CIDEC基因不同单倍型转录活性的检测方法，其中，步骤(3)所述的酶切体系为:KpnI和XhoI各5 μ L，IOXBuffer MlO μ L，纯化产物或pGL3-Basic载体质粒〈5 μ g,超纯水补至100 μ L。如上述技术方案所述的黄牛CIDEC基因不同单倍型转录活性的检测方法，其中，步骤(5)所述的连接体系为:10XT4DNA Ligase Bufferl μ L, DNA 片段 XyL，pGL3_Basic载体(约50叩/^1^)1口1^，T4DNA Ligase (3U/μ L) I μ L，加超纯水至10 μ L，其中载体与目的片段的摩尔比控制在1:3-1:8。如上述技术方案所述的黄牛CIDEC基因不同单倍型转录活性的检测方法，其中，步骤(6)所述的菌液PCR所使用的引物和扩增条件与步骤(I)中的一样，步骤(6)所述的双酶切体系为:KpnI和XhoI各I μ L，IOXBuffer Ml μ L，连接产物质粒〈0.5 μ g，超纯水补至10 μ L0如上述技术方案所述的黄牛CIDEC基因不同单倍型转录本文档来自技高网...
【技术保护点】
黄牛CIDEC基因（AC_000179.1）5端调控区有十处SNP位点：g.?501G>A;?546T>C;?643T>G;?714T>C;?727C>T;?762C>T;?763C>T;?841T>C;?956G>A;?974C>T，这十处SNP位点在南阳牛群体中共形成了九种单倍型，其中单倍型5，6，7频率过低，所以在转录活性分析中只分析了单倍型1，2，3，4，8，9六种。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈宏，王璟，滑留帅，潘虹，曹修凯，蓝贤勇，胡沈荣，雷初超，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：
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