甜瓜枯萎病抗性品种双侧分子标记鉴定技术利用多聚酶链式反应，借助与甜瓜抗枯萎病基因紧密连锁的双侧分子标记ML430与MR296来扩增特异DNA片段。而抗病品种和感病品种所扩增的DNA片段大小上的差异可通过电泳技术在琼脂糖凝胶上显示在不同的位置，再与标准抗病品种和感病品种中所扩增的DNA片段的大小和位置比对，大小相同或处于同一个位置的即为同一类型的品种。两个分子标记的带型均为抗病类型时，该品种即为抗病品种。本方法取材方便、鉴定准确，不受植物生长发育和气候条件的影响。主要用途：本技术发明专利技术主要用于筛选鉴定抗枯萎病的品种资源，也可用于甜瓜分子标记辅助育种。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术技术专利属于农作物生物技术育种领域，本技术利用多聚酶链式反应(PCR技术)，借助与抗枯萎病基因紧密连锁的双侧分子标记ML430和MR296来扩增甜瓜基因组特定区段的DNA片段。抗病品种和感病品种所扩增的DNA片段大小有差异，通过电泳技术可以在图片上现象出来，即可根据此片段的大小判断被鉴定品种对枯萎病的抗病性。
技术介绍
甜瓜枯萎病(Fusarium oxysperium)是瓜类严重病害之一,常造成大片瓜田植株死亡，甚至绝收，而且为害程度逐年加重。据调查，一般发病年份发病株率20%-30%，死亡株率10%左右；重发生年发病株率在30%以 上，死亡株率高达30%—50%，甚至绝产(孙桂华等，2005)。该病是典型的土传病害，从苗期到成株期均可发病，结瓜中期为发病高峰，常引起瓜秧枯萎死亡，对瓜的品质、产量影响很大。甜瓜抗病主基因的发现目前，据报道甜瓜枯萎病的抗性主基因比较明确的主要有3个。1973年，Risser报道了两个抗病基因，分别为Fom-1和Fom_2。其中，Fom-1来自品种Doublon，抗甜瓜枯萎病专化型生理小种0和2，感生理小种I和1.2，Fom-2来自品种CM17187，抗生理小种0和I，感生理小种2和1.2，Joobeur等2004年克隆分离到该基因。Zink (1985)在品种Perlita FR中发现了第3个抗病基因Fom_3，该基因与Fom-1不等位，抗生理小种0和2。甜瓜中与枯萎病连锁的分子标记的开发 Joobeur等2004年在克隆抗枯萎病主基因Fom-2的研究中，发现有多个分子标记与Fom-2紧密连锁，遗传顺序为SSR430-SSR138-Fom-2 -SSR181-SSR184-STS296-SSR180，可用来辅助筛选与鉴定 Fom_2。另夕卜，Ali Oumouloud 等(2008)利用 Charentais-Foml XTRG-1551 组合的 F2 群体，筛选到 3个 RAPD 标记(B17649, V01578, and V061092)与 Fom-1 连锁。甜瓜品种抗枯萎病的鉴定方法危害甜瓜的主要是尖镰刀菌甜瓜专化型的病原菌。常用鉴定方法主要是苗期人工接种鉴定方法，一种是浸根法，另一种是伤根法。人工接种鉴定法有一定的局限性，能否观察到病症收到孢子浓度、接种和观察时间、鉴定期间的温度和湿度的影响。分子标记鉴定方法能有限克服人工接种鉴定的局限性。第一，取材方便，可利用种子、根、茎、叶片等植株的任意组织器官；第二，不受苗的发育时间影响，在整个发育期均可鉴定；第三，不受发病条件的影响，直接从DNA水平上发现片段大小的差异，从而判断抗病性。但也有一定的局限性，即分子标记与抗病基因是否连锁紧密，距离越近，鉴定结果越准确，反之，则不准确，特别是利用单个标记进行鉴定时。本研究利用与抗枯萎病基因紧密连锁的双侧分子标记，可降低单侧标记由于遗传交换而发生的误判现象。
技术实现思路
要解决的技术问题:本研究为了克服人工接种鉴定甜瓜枯萎病抗病性不准的缺点，即鉴定结果易受到接种用孢子浓度的大小、接种和观察时间、鉴定期间的温度和湿度的影响，从而造成错判现象。本技术专利技术则利用与抗枯萎病基因紧密连锁的双侧分子标记来直接扩增各品种的DNA序列，再根据抗病、感病标准鉴定寄主的DNA片段进行比较，就可鉴定品种是否有抗病性。本技术取材方便、不受发病条件的影响，鉴定准确，苗或植株是否发病都可用于鉴定。本技术专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是: (1)采用CTAB法从任意组织或器官(如种子、根、叶片、茎杆等)中提取基因组DNA； (2)以基因组DNA为模板，利用与Fom2连锁的分子标记扩增不同品种的特异DNA片段，即PCR技术的应用； (3)利用2-3%的琼脂糖凝胶电泳技术，分离从不同品种中所扩增的与枯萎病基因连锁的DNA片段，使不同大小的DNA片段跑在不同的位置； (4)凝胶电泳结果成像，即将电泳好的胶放在紫外线下，经过染色的DNA可在紫外线下显现出来，从而肉眼可看到从不同品种中扩增的DNA片段跑在胶中的位置，离点样孔距离远的，是小DNA片段，离得近的，即跑的慢的就是大DNA片段； (5)与标准鉴定寄主所扩增的片段比较，与抗病寄主所扩增的DNA在同一个水平线上的品种则为抗病品种，与感病寄主所扩增的DNA在同一个水平线上的品种则为感病品种。当两侧标记带型均为抗病类型时，该品种为抗病品种；当两侧标记带型均为感病类型时，该品种为感病品种；两侧标记带薪类型不同时，则需要进一步做人工鉴定。 本技术专利技术的有益效果是，可以从DNA水平上根据不同品种所扩增的DNA片段大小，来准确地鉴定出甜瓜品种是否具有抗枯萎病的特性。具体实施例方式1.DNA 提取 采用CTAB方法提取DNA。DNA提取效果比SDS提取方法好，去糖效果明显。具体方法如下: (1)取少量叶片于Eppendorf管中(约70_100mg),置液氮中冷冻Imin； (2)打开管盖，用小木棒捣碎幼叶(注:捣一会儿再放入液氮中，冻后再捣，直到非常碎为止，一般3次为好)；然后，每个管中放入3个小钢珠管中，振荡器振荡3-4次； (3)视材料多少加入600-700ul已预热的DNA提取液(CTAB)，轻轻混匀后，置于65°C水浴保温25 min，其间摇动2_3次； (4)在管中加入等体积的苯酚/氯仿￠00-700111),上下颠倒5min使充分混匀，静置抽提5 min ； (5)4。。下12000r/min离心5 min,吸取上清液到新的Eppendorf管中； (6)加入与上清液等体 积的异丙醇混匀，常温放置10min ； (7)4°C下12000r/min离心5 min，轻轻倒去液体，保留管底离心沉淀物(DNA沉淀物)；(8)加入70%的酒精500-600ul，轻摇离心管，离心，去上清液，再加入70%酒精，反复操作两次； (9)沉淀吹干，50ul TE或ddH20溶解DNA，加0.4%RNase酶备用，或可放入_30°C中保存。2.PCR反应与产物检测 2.1 PCR技术扩增特异片段 采用20ML的反应体系(表5.3.2): PCR的缓冲液2.0ML，的MgCl2 2.0ML，的dNTP 0.4ML，引物 1.5ML，模板 DNA 2.0 ML，Taq 酶 I U，加 ddH20 补足 20ML。PCR 扩增条件为:(1) 94°C 预变性 5min ；(2) 94°C变性 Imin ； (3) 50 - 60。。退火lmin，温度因引物不同而异(引物ML430:正向引物5’-CCATCATGAITTGGAATGAATTAG-3’，反向引物 5’- CGirGCAAITTGATCnTTTAAT-3’；引物 ML296:5’- CCACAAAAAGGAGCTTGACC- 3’；5， - GCCAATTGCCCAAATCAG- 3，。) ;(4)72°C延伸Imin ;扩增30-35个循环；最后，72°C延伸IOmin，4°C保温。 2.2 PCR产物的检测 (I)琼脂糖凝胶(3%)电泳法检测程序(200 ml胶为例): 第一步溶胶称取6 g琼脂糖放入500 ml三角瓶中，加入200 ml T本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种甜瓜枯萎病双侧分子标记鉴定技术，利用PCR技术，通过分子标记扩增DNA片段，比较DNA片段大小和电泳位置，鉴定品种的抗病性。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：邵元健，
申请(专利权)人：邵元健，
类型：发明
国别省市：
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