一种旋毛虫重组蛋白及应用制造技术

本发明专利技术公开一种重组蛋白的制备方法，特别是一种TsSerpin重组蛋白，以及这种蛋白和它的用途。本发明专利技术的TsSerpin重组蛋白的制备方法是：以猪旋毛虫肌幼虫中提取总RNA为模板，以Oligo(dT)18Primer为引物进行反转录；再用上述所得到的反转录cDNA为模板，用SEQID№1和SEQID№2为引物进行PCR扩增，得到猪旋毛虫TsSerpin基因；再经构建重组质粒、转化大肠杆菌等处理得到目标蛋白。本发明专利技术的重组蛋白可用于制备检测旋毛虫病的抗原。

【技术实现步骤摘要】
一种旋毛虫重组蛋白及应用
本专利技术涉及分子生物学领域，主要是旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂基因TsSerpin重组蛋白用于免疫诊断及疫苗研制，具体设计包括旋毛虫基因TsSerpin的cDNA克隆及其在大肠杆菌BL21（DE3）中的原核表达和反应原性的鉴定，并对TsSerpin进行分段克隆及原核表达和反应原性的鉴定表达，筛选反应原性比较好的片段用于免疫诊断。将重组蛋白用于小鼠免疫保护实验，确定其免疫保护性。
技术介绍
旋毛虫病(Trichinellois)是由旋毛虫（Trichinellaspp.）引起的一种危害严重的食源性人兽共患寄生虫病，可在包括人类在内的150多种动物之间广泛传播，人主要因为生食或半生食含有旋毛虫肌幼虫包囊的肉品而感染，严重时可致人死亡。旋毛虫病是一个非常重要的公共卫生问题，不仅给人类健康造成威胁，而且给畜牧业生产造成巨大经济损失。由于旋毛虫病病原传播途径复杂，宿主地理分布广泛，给该病的防制造成了极大的困难，至今仍然未得到有效的控制，而且流行范围继续扩大，已被列为再度肆虐的疾病。卫生部2001～2004年的全国人体重要寄生虫现状调查资料显示，在调查的旋毛虫病流行区的10个省（区、市）中，旋毛虫病血清阳性率为3.38%，但是西部地区的感染率要比东部地区高69.44%，该病已经成为影响我国食品安全和人民健康的重要因素之一。旋毛虫的抗原成份极其复杂，且不能进行体外的大量培养和繁殖，因此给该病的免疫诊断及预防带来了困难。随着分子生物学技术在寄生虫病研究中的应用，基因重组抗原成了当前研究的焦点。目前通过基因工程方法获得的旋毛虫抗原主要有46kDa、49kDa、53kDa等，其重组抗原具有反应原性，可以被感染动物血清识别，但在旋毛虫感染早期诊断仍然不理想。解决诊断抗原的途径之一就是筛选鉴定旋毛虫不同发育时期的抗原表位进行融合表达以获得特异、敏感的诊断抗原。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服当前旋毛虫病免疫诊断技术中的不足，即旋毛虫肌幼虫排泄分泌（ES）抗原大量制备相对较难，从旋毛虫肌幼虫中获得TsSerpin基因，对TsSerpin进行反应原性分析，并确定TsSerpin的抗原表位区域。同时对TsSerpin进行免疫诊断和保护性试验研究，为旋毛虫的诊断和预防奠定基础。本专利技术提供了旋毛虫TsSerpin基因的原核表达、蛋白纯化以及反应原性鉴定的方法，其特征在于，包括：（1）设计引物——设计的TsSerpin表达引物分别为：上游引物SEQID№1：（5’-GGCGAATTCATGGAAACAGAAATTGCAA-3，斜体加黑部分为EcoRI酶切位点）；下游引物SEQID№2：5’-CCCTCGAGTTAATTACCAGAAAAACGTCCA-3（斜体加黑部分为XhoI酶切位点）；（2）RT-PCR反应——以旋毛虫肌幼虫RNA为模板，进行RT-PCR扩增，PCR反应条件为反应条件为：94℃5min；94℃1min，55℃1min，72℃1min，35个循环；72℃10min。（3）重组表达菌株的构建——将目的基因与pMD18-T载体连接，转化到E.coliDH5α感受态细胞中，并进行鉴定阳性菌株。将阳性菌株送于测序公司测序，将测序正确的菌株提取质粒，经EcoRI和XhoI双酶切后，纯化酶切产物，将目的基因连接到pET30a表达载体上，转化到E.coliBL21(DE3)感受态细胞中，挑取单个菌斑，提取质粒，得到TsSerpin基因的阳性重组表达质粒pET30a-TsSerpin。（4）重组表达质粒pET30a-TsSerpin在大肠杆菌中的表达——取pET30a-TsSerpin/BL21(DE3)菌液加入到卡那霉素（100μg/mL）的LB液体培养基，37℃，200rpm过夜培养。第二天转接至新鲜的含卡那霉素的LB培养基（1：50），继续培养至OD600为0.6左右。在其它条件不变的前提下，分别在28℃、32℃、37℃和42℃等不同温度诱导表达；同样以0.1mmol/L、0.3mmol/L、0.5mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L、1.2mmol/L、1.5mmol/LIPTG诱导表达；收集诱导后lh、2h、3h、4h、5h、6h及过夜表达菌液，最后通过SDS-PAGE鉴定表达产物，来确定该重组蛋白的最佳表达条件。（5）重组蛋白的纯化——采用切胶后电洗脱法纯化重组蛋白。并用紫外分光光度计测定蛋白含量。（6）Western-blot方法检测重组表达蛋白反应原性——将纯化的重组蛋白进行SDS-PAGE电泳后转移至硝酸纤维膜上，以旋毛虫感染猪血清（20000条肌幼虫经口感染160d）和健康猪血清中作为一抗、碱性磷酸酶标记羊抗猪IgG为二抗，进行Western-blot分析。（7）按照以上方法将旋毛虫基因TsSerpin进行分段克隆表达，并进行反应原性的分析。(8)将有反应原性的TsSerpin重组蛋白和分段表达的TsSerpin重组蛋白分别命名为TsSerpin1和TsSerpin5。对TsSerpin1和TsSerpin5分别进行免疫诊断的研究。（9）将110只健康昆明小鼠随机的分为四组，分别为TsSerPIN1免疫组（30只）、TsSerPIN5免疫组（30只）、佐剂组（25只）和感染对照组（25只）。TsSerPIN1免疫组用TsSerPIN1重组蛋白（200µg/mL）加入等体积ISA206油佐剂乳化后，每只小鼠腹腔注射0.2mL；TsSerPIN5免疫组用TsSerPIN5重组蛋白（200µg/mL）加入等体积的ISA206油佐剂乳化后，每只小鼠腹腔注射0.2mL。佐剂组用PBS加入等体积的ISA206油佐剂乳化后每只小鼠腹腔注射0.2mL。感染对照组用PBS代替免疫原直接进行腹腔注射，每只小鼠0.2mL。各组均进行3次免疫注射，每周1次，第3次免疫后1周攻击感染，每只小鼠经口攻击感染旋毛虫肌幼虫200条。其中TsSerPIN1免疫组和TsSerPIN5免疫组各有10只小鼠作为免疫对照（即只进行免疫而不攻击感染旋毛虫）。本专利技术人以旋毛虫为研究对象，从旋毛虫肌幼虫中克隆到旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂基因TsSerpin。完成了该基因全长序列的克隆及序列分析，并对其进行原核表达及反应原性的鉴定，同时对TsSerpin进行了分段克隆及原核表达和反应原性鉴定，并对反应原性较好的重组蛋白进行免疫诊断与免疫保护性的研究，以筛选鉴定旋毛虫TsSerpin基因的抗原表位，获得特异性，敏感性好的诊断用抗原及疫苗研制候选抗原，为旋毛虫病的诊断和预防奠定基础。本专利技术的优点在于克隆到了旋毛虫肌幼虫丝氨酸蛋白酶抑制剂基因TsSerpin，western-blot检测结果显示TsSerpin重组蛋白具有很好的反应原性，分段表达TsSerpin，western-blot检测结果显示TsSerpin5重组蛋白具有很好的反应原性，动物实验证明该重组蛋白具有一定的保护性。选择TsSerpin5重组蛋白做为旋毛虫病的诊断抗原和疫苗研制候选抗原，为旋毛虫基因重组抗原的研制奠定了基础。附图说明图1TsSerpin基因RT-PCR扩增产物，其中：M：DNA分子质量标准(DL2000)；1：RT-PCR扩增产物；2：空本文档来自技高网...

【技术保护点】
TsSerpin重组蛋白的制备方法，其特征是：1）从猪旋毛虫肌幼虫中提取总RNA；2）以Oligo(dT)18?Primer为引物，总RNA为模板进行反转录；3）用上述2）所得到的反转录cDNA为模板，用SEQ?ID?№1和SEQ?ID?№2为引物进行PCR扩增，得到猪旋毛虫TsSerpin基因；4）将所得到的旋毛虫TsSerpin基因与pMD18?T克隆载体连接，构建pMD18?TsSerpin重组质粒；5）测序正确的重组质粒经过EcoR?I?和Xho?I进行双酶切，酶切产物进行纯化后与载体pET30a连接，转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，构建原核表达重组质粒pET30a?TsSerpin；6）将旋毛虫pET30a?TsSerpin重组质粒进行诱导表达；7）对经诱导表达的旋毛虫TsSerpin重组蛋白进行纯化处理。

【技术特征摘要】
1.TsSerpin基因片段蛋白TsSerpin5制备方法，其特征是：1）从旋毛虫肌幼虫中提取总RNA；2）以Oligo(dT)18Primer为引物，总RNA为模板进行反转录；3）用上述2）所得到的反转录cDNA为模板，用SEQID№1和SEQID№2为引物进行PCR扩增，得到旋毛虫TsSerpin基因；4）将所得到的旋毛虫TsSerpin基因与pMD18-T克隆载体连接，构建pMD18-TsSerpin重组质粒；5）测序正确的重组质粒经过EcoRI和XhoI进行双酶切，酶切产物进行纯化后与载体pET30a连接，转化大...

【专利技术属性】
技术研发人员：付宝权，盖文燕，李文卉，曲自刚，谢志宙，刘静宜，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：