本发明专利技术涉及一种对粘壁细胞施加至少一个电场的方法。在所述的方法中，采用至少三个电极63、64时，通过对至少两个有源电极63施加电压产生所述的电场，当施加电压产生第一电场时至少两个电极63、64是有源电极63，并且产生至少一个第二电场，在施加电压时两个之前的有源电极63中至少一个是无电位电极64。本发明专利技术还涉及一种包括至少三个电极63、64的装置58，所述电极通过至少一个开关装置59、60、61、62与至少一个电压源相连，至少五个电极63、64通过四个开关装置59、60、61、62与至少一个电压源相连，至少两个电极63、64通过共同的开关装置59、60、61、62与电压源相连。本发明专利技术所述的装置与上述方法相结合就能利用电场有效均匀处理粘壁细胞，可以用少量开关装置迅速可靠地在有源电极和无电位电极之间切换。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】均匀处理粘壁细胞的方法和装置
技术介绍
本专利技术涉及一种对粘壁细胞施加至少一个电场的方法。在该方法中，采用至少三个电极时，通过对至少两个有源电极施加电压产生所述的电场。本专利技术还涉及一种包括至少三个电极的装置，所述电极通过至少一个开关装置与至少有一个电压源相连。本专利技术也涉及一种与至少两个电极组件接触的装置，所述电极组件各自包括至少两个电极，所述至少两个电极组件具有不同的尺寸，并且所述装置具有可用来与电极组件的电极形成电接触的接触元件。技术现状对活细胞施加电场或电压脉冲的方式称作电穿孔或电转染，多年以来就将其应用于各种不同状态下的细胞。悬浮在缓冲液中的单细胞在培养皿中的粘壁状态下通常粘附在塑料容器的底部上，体内细胞通常在组织复合体中嵌入到细胞外基质之中。进行电穿孔时原则上可通过瞬间电流从与细胞相配的缓冲液或者细胞培养基中将外源分子送入细胞之中，通过电压脉冲或者由此产生的电场和电流的作用使得外源分子可以透过细胞膜。细胞悬液通常位于比色皿之中，这是一种细窄开口的容器，其样品室在侧壁中有两个相对而置、用于施加电压的近似平行的电极。生物活性分子首先通过细胞膜中瞬间出现的“微孔”进入细胞质之中，这些分子有时已经可以在细胞质中发挥其待研究的功能，然后在一定条件下也会进入细胞核之中。除此之外，瞬间施加强电场也就是电流密度很高的短电压脉冲，还可以融合细胞、细胞衍生物、亚细胞颗粒和/或者囊泡。当采用这种电融合方式时，例如首先通过不均匀的交变电场使得细胞膜紧密接触，随后施加电场脉冲使得部分膜相互作用最终融合。可以将与电穿孔装置类似的装置用于电融合。除此之外，通过施加电场也能以改变其特性的方式刺激活细胞。例如WO 2005/056788 Al公开了一种用于电穿孔的方法，按照该方法所述，细胞在位于两个平行电极表面之间的微孔膜上生长。US-A-5134070描述了细胞电穿孔的应用和装置，细胞在作为电极的导电表面上生长。从上方使用一个板状的对应电极遮盖培养皿，同时形成一个可以放电的间隙。WO 2008/104086 Al还公开了一种装置，细胞可在所述装置中共面的电极表面上生长。通过细胞上方的细胞培养基形成电极之间的电接触，两个电极区域被隔离屏障分开，尽管如此该屏障仍然允许在电极之间有一个电解液桥，这些电极例如可以由铟锡氧化物构成，铟锡氧化物是透明半导体，可实现对细胞进行显微分析。WO 2009/131972 Al公开了一种对附着生长在圆形盘状板上的细胞进行分析的装置。该装置具有两个相互平行的电极，其中一个电极位于外侧圆柱体的凹面上，另一个电极位于内侧圆柱体的凸面上。US 2009/0305380 Al还公开了一种对固定在固定面上的细胞进行电穿孔的装置，通过在固定面上方的表面上紧密相邻的电极对阵列产生施加给细胞的电场。通过镀在表面上的迹线 构成电极。电极对的两个电极适当紧密相邻排列，从而在两个电极之间极小的间距之内不可能有一个以上的细胞。BTX公司销售一种名为PetriPulser 极性交替变化的电极板组件，可以将其垂直放在培养皿中附着生长的细胞上。电极浸没在培养上清液之中，各个电极板之间的间隙均充满培养基。该组件的主要缺点在于，大部分电流会经由细胞上方的无细胞培养基流出。电场仅仅在边缘电场中作用于细胞所在的容器底部上，因此要提供不必要的高电流。PH值变化和高电流必然还会引起很高的细胞死亡率。除此之外，还必须针对持久的电压脉冲将电源设计得非常大，才能提供如此大的电流以及电荷量和功率。此外所涂覆的量还必须适合于电穿孔，并且必须含有充分高浓度的待转染底物，因此底物用量也相当高。这种已知装置的另一个主要缺点在于，自由电极尖端正上方区域中的电场极小。这会导致实际上无法转染或融合位于该区域中的细胞，从而使得利用这种已知装置执行的方法的效率总体上很小。本专利技术的描述本专利技术的任务在于，提供能够利用电场有效均匀处理粘壁细胞的一种方法和一种装置。 采用上述类型的一种方法即可解决本专利技术的任务。按照所述的方法，当施加电压产生第一电场时至少两 个电极是有源电极，并且至少产生一个第二电场，当施加电压时两个之前的有源电极中至少一个是无电位电极。例如当第一电极正在对细胞施加电压脉冲时，要么是正极或者负极，则该电极下方的电场极小，使得位于该电极正下方的细胞无法得到充分电处理。因此按照本专利技术所述产生第二电场，所述的第一电极现在没有电位(无源)，也就是通过对至少两个其它电极施加电压产生电场。这样即可在第二电压脉冲过程中也对所述第一电极下方的区域施加电场。因此采用本专利技术所述的方法可保证同样也能对第一电压脉冲过程中处在电场之外的细胞进行充分电处理。利用本专利技术所述的方法能将电场很小的区域的数量减少到最低程度，从而能够优化相应方法的效率，例如优化电转染或电融合的效率。本专利技术所述的方法有助于保证利用电场有效均匀处理粘壁细胞。适宜产生适当多的电场，使得产生第一电场时的所有有源电极在产生其它电场的过程中至少有一次为无电位电极。以这种方式可保证电极下方不存在没有对其施加过电场的区域。因此在这种最佳情况下可利用电场均匀处理所有细胞，从而能够保证相应方法的效率，例如电转染或电融合的效率。按照本专利技术的另一种有益实施方式所述，每个电场通过至少一个电压脉冲、适宜通过至少两个电压脉冲产生。按照本专利技术所述，可以通过一个单一的电压脉冲或者至少两个或多个顺序或者相互过渡的(部分)电压脉冲产生电场。可以通过一个或多个电荷储存器尤其是一个电容或至少两个电容的放电来产生次脉冲。产生电场的每个电压脉冲适宜是由一个短高压脉冲和一个电压较小的长脉冲组成的双脉冲。例如可通过两个电容依次放电的方式产生这种双脉冲，两个次脉冲可以连续相互过渡。例如第一电荷储存装置可以具有至少IOiI F、适宜至少50 i! F、尤其至少IOOiiF的电容，并且/或者放电起始电压为10 1500V，适宜为20 1200V，尤其为50 1000V，脉冲持续时间为2 y s 40ms，适宜为5u s 20ms,尤其为IOii s 10ms。在第一电荷储存装置放电结束之前、同时或者之后,可以使得例如电容至少为IOOii F、适宜至少为500 ii F、尤其至少为IOOOii F的第二电荷储存装置放电，放电起始电压例如为10 240V、适宜为20 200V、尤其适宜为50 150V，脉冲持续时间例如为Ims 500ms、适宜为2ms 350ms、尤其为4ms 250ms。可以同时或者代之以通过至少一个电压脉冲产生至少两个电场，两个电压脉冲之间的时间间隔至少为500ms，适宜至少为ls，尤其为I 10s。令人惊奇的是，本专利技术所述产生电场的电压脉冲(非次脉冲！)之间的时间间隔必须比较大，才能使得细胞的存活率保持稳定并且/或者能够保证该方法的高效率。每一个电压脉冲也可以如同以上所述由多个、至少两个次脉冲组成。按照本专利技术的另一种有益实施方式所述，采用多个反应腔，在其中分别对粘壁细胞施加电场，将其中一个反应腔中用于产生两个电场的两个电压脉冲之间的时间间隔用于在至少另一个反应腔中产生至少一个电场。如果必须在极短的时间之内、尤其以高流量方法处理很多试样，则本专利技术的这种实施方式特别有益。如上所述，用于在相应反应腔中产生电场的各个电压脉冲相互间可以有比较大本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：T·科布利泽克，A·海因策，T·格莱斯纳，H·穆勒哈特曼，A·维尔特，
申请(专利权)人：隆萨科隆有限公司，
类型：
国别省市：
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