一种用于表征外周调节性T细胞抑制活性的特征细胞群的检测方法及其应用技术

本发明专利技术涉及医药领域，特别是涉及一种用于表征外周调节性T细胞抑制活性的特征细胞群的检测方法及其应用，更为具体的说是涉及一种用于表征外周调节性T细胞抑制活性的特征细胞群的检测方法及其在用于制备调节性T细胞抑制活性检验试剂盒中的应用、以及在用于制备筛选胰腺早期病变靶标的试剂盒中的应用。否定了外周免疫调节细胞群与它应具备的调节功能间存在矛盾，免疫调节细胞的数量高低与它应该发挥的作用无关的业内普遍理论，找到了一组对调节性T细胞抑制活性具有表征价值的细胞群，并进一步公开了相应的细胞群检测方法，从而对调节性T细胞抑制活性，以及筛选胰腺早期病变靶标奠定了重要的基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及医药领域，特别是涉及一种用于表征外周调节性T细胞抑制活性的特征细胞群的检测方法及其应用，特别的说是一种用于表征调节性T细胞抑制活性变化和靶向组织免疫应答机制及其应用，是发现一种用于表征调节性T细胞中具有抑制活性的细胞群的状态变化而介导靶向组织免疫应答之间的机制，及其在用于动态监测调节性T细胞抑制活性试剂盒中的应用、及在用于制备筛选胰腺早期病变靶标的试剂盒中的应用。
技术介绍
研究发现自体免疫性糖尿病是一种自发免疫性疾病并呈现渐进性发展过程，由于免疫调节活性下降，降低其对内源性效应T细胞的抑制效应，由效应T细胞而介导的特异性攻击胰岛β细胞一即体内唯一合成分泌胰岛素的单位，因此，胰岛破坏的结果直接造成胰岛素分泌数量减少，而胰岛素的功能将血中的葡萄糖运至相应的细胞内，供细胞正常生理活动需要。胰岛素数量减少又直接影响到血中的葡萄糖代谢利用。当80 90%的胰岛被破坏使得胰岛素分泌数量降至临界值时，尚存的内源性胰岛素无法维持生理所需的糖代谢，血中的葡萄糖异常升高，此时发展成为临床期的I型糖尿病。疾病发展至此，病人表现出相应的临床症状和体征，实验室检查发现血液和尿液中的葡萄糖值升高，以及其它的一些辅助检查都可以帮助诊断，但主要是依据血糖的升高程度诊断糖尿病。目前对I型糖尿病的发病机制和诊治中存在局限；首先，虽然学术界对外周免疫耐受失衡是造成自体免疫病发生的成因已经有共识，即耐受平衡调节的关键取决于免疫调节细胞群的表达，但一些科学·实验中发现免疫调节细胞群高低与它应具备的调节功能间存在矛盾，研究发现免疫调节细胞的数量高低与它应该发挥的作用无关(Anne Cooke英国剑桥大学发表在国际免疫学杂志)，免疫调节细胞群中存在“僵尸细胞”，因此如何界定具有确切调节功能活性的靶位成为关键；其次，由于血糖持续的异常升高受到很多因素的影响，波动较大且容易有误差，而且只有在胰岛被破坏减少到临界值后，内在的病变发展至临床期后才表现出来。因此，不能全面和系统体现疾病的发生和进展，尤其无法反映免疫攻击胰岛细胞的早期病变，另外，胰腺组织活检虽然可以反映病变局部的病理变化，它却受到活检带来的手术创伤等并发症以及无法被医生和患者接受的制约。
技术实现思路
本专利技术突破目前自体免疫病发病机制研究中的困局，解决了单纯依赖外周免疫调节细胞表达量的高低无法客观体现它实际发挥的调节功能间的矛盾，找到特异性靶位可以科学地反映调节性T细胞免疫抑制活性，并进一步公开了相应的细胞群检测方法，从而实现动态监测调节性T细胞抑制活性状态，以及作为筛选自体免疫糖尿病的靶器官胰腺早期病变的靶标，奠定了重要的基础。具体地，本专利技术公开了一种用于表征外周调节性T细胞抑制活性的靶向细胞群的检测方法，包括以下步骤: 步骤I)将待测样本处理，形成单细胞悬液；具体来说，将待测外周血或动物脾脏按照常规方法处理，去红细胞过滤后制备得到淋巴细胞悬液； 步骤2)特征细胞群的抗体染色: 将上述单细胞悬液分别与标记不同荧光的单抗体⑶3、⑶4、⑶69混匀，冰上孵育30分钟； 步骤3)混合液PBS洗液调匀，加入细胞破膜裂解液，混匀冰上孵育30分钟，再用细胞破膜辅液，充分混匀后离心，去上清； 步骤4)新鲜配制脱氧核糖核酸酶液，加入到步骤4)中所得沉淀中，混匀后孵育60分钟，再用细胞破膜辅液，充分混匀后离心，去上清， 步骤5)加入抗体Fe阻断剂，充分作用20分钟； 步骤6)分别加入检测标记调节细胞表位的转录因子(FoxP3)和脱氧核糖核酸(BrdU)复制的抗体；所述的BrdU、FoxP3分别采用不同荧光标记，分取1.5 μ I抗体冰上孵育30分钟，再用细胞破膜辅液200 μ 1，洗涤细胞悬液，充分混匀后离心，去上清； 步骤7)流式细胞仪检测:` 加入流式细胞洗液充分混匀后离心，去上清，加入500ul流式细胞洗液，流式细胞仪检测得到染色的活性调节性T细胞的占比。进一步地，本专利技术还公开了所述步骤2)中，单细胞悬液与标记了不同荧光的单抗体的混合比例分别为:单细胞悬液与⑶3以体积计算为1:400、单细胞悬液与⑶4以体积计算为1:200、单细胞悬液与⑶69以体积计算为1:150 ;单细胞悬液与BrdU以体积质量比计算为1.5ul:1 ug、单细胞悬液与FoxP3以体积质量比计算为1.5ul:lug。作为进一步的优化，本专利技术还公开了步骤I)中所述单细胞悬液的终浓度为I X 107/ml,混匀后取IOOul的细胞悬液为实验对象。同时，本专利技术还公开了所述步骤2)中，细胞悬液与⑶3、⑶4、⑶69在4°C的条件下结合孵育30分钟，再用PBS洗涤2次。不仅如此，本专利技术还公开了所述步骤4)中，所得沉淀用细胞破膜辅液重复洗涤一次，充分混匀后离心，去上清。本专利技术在总体调节性T细胞中通过发现靶位找到具有实际调节功能的细胞群，并通过本专利技术公开的抗体染色方法，将这一特征细胞群同时表征并定量统计出来，达到科学量化具有抑制活性的调节性T细胞的目的，解决了目前业内普遍存在的因单纯关注调节性T细胞总数量，而造成对免疫调控机能状态错判的问题；也科学解释了调节机制在自体免疫病特别是I型糖尿病发生、发展的病理进程中的作用。同时，本专利技术所公开的特征细胞群检测方法，推广到I型糖尿病患病及潜在发病人群，以外周静脉血作为检测样本，从而为检测调节性T细胞抑制活性、以及无创伤地筛选胰腺早期病变靶标奠定了基础。同时，本专利技术进一步公开了所述的用于表征调节性T细胞抑制活性的特征细胞群的检测方法在用于调节性T细胞抑制活性试剂盒中的应用。特别是在用于靶向检测调节性T细胞抑制活性试剂盒中的应用。以及所述的用于表征调节性T细胞抑制活性的方法在用于制备筛选胰腺早期病变靶标的试剂盒中的应用。特别是靶向检测外周调节性T细胞抑制活性的方法在用于制备筛选胰腺早期病变靶标的试剂盒中的应用。从而克服了常规的血糖监测无法客观并全面反映出自身免疫攻击胰岛细胞不同阶段病变的局限，以及胰腺组织活检带来的手术创伤等并发症的难题。本文中FoxP3是指转录因子；BrdU是指5_溴脱氧尿嘧啶核苷。附图说明图1-1为处于模型第四周雌鼠的淋巴细胞流式细胞仪检测结果； 图1-2为处于模型第十周雌鼠的淋巴细胞流式细胞仪检测结果； 图1-3为处于模型第十六周雌鼠的淋巴细胞流失细胞仪检测结果； 图2为实施例10中处于疾病进程不同阶段的雌鼠对应的特征细胞群在调节性T细胞总量中占比的曲线示意 图3-1为实施例11中A组小鼠的淋巴细胞流式细胞仪检测结果； 图3-2为实施例11中B组小鼠的淋巴细胞流失细胞仪检测结果； 图4-1为处于模型第四周的雌鼠的胰脏染色标本； 图4-2为A组小鼠的胰腺染色标本； 图4-3为处于模型第十周的雌鼠的胰脏染色标本； 图4-4为B组小鼠的胰腺染色标本； 图4-5为处于模型第十六周的雌鼠的胰腺染色标本； 图5为处于胰腺病变不同阶段的雌鼠对应的特征细胞群在调节性T细胞总量中占比的曲线示意 图6为实施例13中胰腺病变不同阶段的雌鼠的血糖示意 图7为实施例14中治疗组与对照组雌鼠的特征细胞群在调节性T细胞总量中占比的最终状态不意 图8为实施例14中治疗组与对照组雌鼠的血糖示意图。 具体实施例方式下面结合实施例和附图进一步说明本专利技术，在以本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于表征外周调节性T细胞抑制活性的特征细胞群的检测方法，其特征是该方法包括以下步骤：步骤1）将待测样本处理，形成单细胞悬液；步骤2）特征细胞群的抗体染色：将上述单细胞悬液分别与荧光抗体CD3、CD4、CD69混合；步骤3）混合液以流式细胞洗液调匀，加入细胞破膜裂解液，混匀冰上孵育30分钟，再用细胞破膜辅液，充分混匀后离心，去上清；步骤4）新鲜配制脱氧核糖核酸酶液，加入到步骤4）中所得沉淀中，混匀后孵育60分钟，再用细胞破膜辅液，充分混匀后离心，去上清，步骤5）加入抗体Fc阻断剂，充分作用20分钟；步骤6）分别加入检测标记调节细胞表位的转录因子（FoxP3）和脱氧核糖核酸复制（BrdU）的抗体；?所述的BrdU、FoxP3分别采用不同荧光标记，分取1.5μl抗体冰上孵育30分钟，再用细胞破膜辅液200μl，洗涤细胞悬液，充分混匀后离心，去上清；步骤7）流式细胞仪检测：加入流式细胞洗液500ml，充分混匀后离心，去上清，加入流式细胞洗液，流式细胞仪上机检测。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：史其新，
申请(专利权)人：史其新，
类型：发明
国别省市：