本发明专利技术涉及一种复合检测戊型肝炎病毒抗体谱的试剂盒及其应用，包括以下组分：a)捕获微球；b)不同荧光标记的三种二抗；c)磷酸缓冲液。本发明专利技术还提供一种利用流式微球检测技术复合检测同一体系中戊型肝炎病毒抗体谱的方法。本发明专利技术优点在于：克服传统单种抗体检测假阴性、假阳性率高的缺陷，提高检测灵敏度和特异性；还可用于HEV病毒感染的分期；利用流式微球检测技术，反应过程一步完成，可以提高检测效率和自动化程度。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及免疫学检测领域，具体地说，是一种利用流式微球检测技术复合检测戊型肝炎病毒抗体谱的试剂盒。
技术介绍
戍型肝炎(Hepatitis E, HE)是由戍型肝炎病毒(Hepatitis E virus, HEV)弓丨起的经消化道传播的急性传染病，发病率逐年升高，目前尚无特效治疗方法。戊型肝炎广泛流行于亚、非及美洲一些国家，发病例呈全球性分布，是发展中国家较常见的传染病，我国为高发区。当成人感染HEV后，会出现尿黄、眼睛黄、皮肤黄发热，乏力、食欲减退、厌油、恶心、呕吐、上腹不适、肝区痛关节痛等症状。病情严重的病人可发生暴发性肝功能衰竭，肝昏迷，弥漫性血管内凝血等危及生命的并发症，孕妇感染HEV后，病死率高(5% 25%)，还会造成流产和死胎。目前，HE V病毒的检测方法主要有核酸检测和免疫学检测。HEV RNA检测是临床戊型肝炎诊断的金标准，但该方法操作复杂、成本高，不易在临床广泛开展，而且在急性戊型肝炎患者中，血液或粪便中HEV RNA存在的时间较短，所以临床HEV的诊断主要依靠血液HEV抗体检测。抗HEV IgM是HEV急性感染的诊断指标之一，在感染HEV第2周就可以在血清中被检测到，第6周达到高峰，随后迅速下降，阳性持续时间较短(3个月左右)，因此抗HEV IgM现有诊断试剂常有漏诊和误诊。这部分漏诊的带毒者即成为HEV的移动传染源，有可能是造成HEV区域性小规模流行和持续散发的原因。此外，类风湿因子等的存在会影响血清IgM的检测，造成假阳性，这在其他疾病检测中屡见不鲜，抗-HEV IgM检测也不例外。这说明现有的IgM诊断试剂尚不能满足HEV感染的临床诊断和流行病学筛查与防治的需要。抗HEV IgG 一般在发病2周后可检测到，在第7周达到高峰，并能一直保持在较高的水平，可持续I年甚至数年，因此抗HEV IgG检测是目前HEV病毒感染诊断主要依据。但是抗HEV IgG不能鉴别患者为HEV急性感染还是既往感染。有研究表明IgG抗体亲和力高低测定可诊断是否为急性感染，通常感染初期IgG亲和力低，恢复期IgG亲和力高，但重复感染患者通常也表现为IgG亲和力高。这种情况在孕妇弓型虫感染患者中也有报道。虽然抗体亲和力能用来区分感染时间，特别是亚临床和无黄疸的患者，也可以鉴定抗HEV IgM阴性的急性感染，但高和低亲和力的区分不得不凭经验，而且不是所有急性感染都是抗-HEV IgG亲和力都低，也有的患者发病早期抗HEV IgG阳性，而亲和力高，因此抗体亲和力实验只能作为一种验证实验。人体感染HEV后3 4周，首先出现抗HEV IgM和IgA，此后约I周即可检测到抗HEV IgG。IgA抗体被证实在一些病毒性疾病的急性感染期升高，可以作为早期诊断的标志。在大部分HEV早期感染患者中，可检测到抗HEV IgM和抗HEV IgA阳性，但抗HEV IgA阳性持续时间比抗HEV IgM长，平均约为(120±23)d，对HEV感染的早期诊断更有意义。流式微球技术(cytometric bead array, CBA)是流式细胞技术与微球相结合的一项新技术，是近年发展起来的一种定量检测细胞分泌或裂解释放的细胞因子或其他可溶性蛋白的重要方法，与传统的ELISA方法相比，CBA具有EL ISA所无法比拟的优点。CBA的技术原理是利用有机高分子微球为载体，用特异性抗原/抗体(捕获抗体)进行包被，再与标准品/或待检样本及荧光素标记的特异性抗原/抗体(检测抗体)一起反应，然后用流式细胞仪对其进行定量检测。如果将多种荧光强度具有明显差异的微球，分别用不同抗原的特异性抗体包被，将包被好的微球(捕获微球)混合，并与标准/或待检样本及荧光素标记的特异性检测抗体一起反应，可对样本中的多种可溶性蛋白质同时进行定量。该技术在液相环境中进行，可保持蛋白质构象不变，有利于抗原抗体结合，且有高通量、快速分析多重生物反应、高的灵敏度和特异性等传统ELISA无法比拟的优越性，已广泛应用于医学领域。中国专利文献CN102375052A公开了一种在同一体系中检测IgM抗体和IgG抗体的方法，但是关于一种利用流式微球检测技术复合检测戊型肝炎病毒抗体谱的试剂盒目前还未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，提供一种复合检测戊型肝炎病毒抗体谱的试剂盒。本专利技术的再一目的是，提供一种复合检测戊型肝炎病毒抗体谱的试剂盒的应用。本专利技术的另一的目的是，提供一种利用流式微球检测技术复合检测同一体系中戊型肝炎病毒抗体谱的方法。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案是:一种复合检测戊型肝炎病毒抗体谱的试剂盒，包括以下组分: a)捕获微球，所述的捕获微球为包被有不同HEV特异性抗原的聚苯乙烯微球，所述的HEV特异性抗原为HEV病毒基因组ORF 2和ORF 3重要抗原位点融合表达的戊肝抗原； b)荧光标记的三种二抗，其中三种二抗为针对人HEVIgG、IgM、IgA抗体的二抗，所述的三种二抗标记的荧光基团各不相同； c)磷酸缓冲液。所述的a中HEV特异性抗原为人HEV IgG、IgM和IgA抗原。所述的a中聚苯乙烯微球为羧基表面微球。所述的b中的三种二抗为羊抗人IgG、羊抗人IgM、羊抗人IgA，荧光基团选自FITC, PE, PI, CY5, preCP、ECD 中的三种。所述的c中磷酸缓冲液的浓度0.01mol/L, pH7.4。所述的a中捕获微球的制备方法为:将偶联液、洗涤液、封闭/储存液放置到室温备用，所述偶联液为NaH2PO4 0.lmol/L, ρΗ6.2，所述洗涤液为PBS 0.01mol/L, ρΗ7.4，所述封闭/储存液为PBS+l%BSA+0.02% NaN3 取微球用洗涤液冲洗；②加入活化缓冲液和EDC和NHS活化剂，混匀；③室温下避光摇震通向活化的微球中加入HEV特异性抗原，混匀； 室温下避光摇振用洗涤液冲洗；⑦加入封闭液；⑧室温下避光摇震；⑨将包被好的微球放在储存液中4°C避光保存。为实现上述第二个目的，本专利技术采取的技术方案是:所述的试剂盒在制备检测戊型肝炎病毒抗体谱的检测器械中的应用。为实现上述第三个目的，本专利技术采取的技术方案是:一种利用流式微球检测技术复合检测同一体系中戊型肝炎病毒抗体谱的方法，包括以下步骤:a)捕获微球的制备，所述的捕获微球为包被有三种不同HEV特异性抗原的聚苯乙烯微球，所述的HEV特异性抗原为人IgG、IgM和IgA抗原； b)待检样品的处理:在同一反应器中，加入待检样品、捕获微球、不同突光标记的三种二抗，孵育后形成微球-抗体-荧光二抗夹心复合物，其中三种二抗为针对人HEV IgG、IgM、IgA抗体的二抗； c)检测和结果判读:用流式细胞仪对经过孵育产生的微球复合物进行分析检测，通过分析三种荧光信号结果可获知待检样品的戊型肝炎病毒抗体谱。所述的b中的三种二抗为羊抗人IgG、羊抗人IgM、羊抗人IgA，所述的荧光基团选自 FITC, PE, PI, CY5, preCP、ECD 中的三种。所述的a中捕获微球的制备方法为:将偶联液、洗涤液、封闭/储存液放置到室温备用，所述偶联液为NaH2PO4 0.lmol/L, ρΗ6.2，所述洗涤液为PBS 0.01mol/L, ρΗ7.4，所述封闭/储存液本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种复合检测戊型肝炎病毒抗体谱的试剂盒，其特征在于，包括以下组分：a)捕获微球，所述的捕获微球为包被有不同HEV特异性抗原的聚苯乙烯微球，所述的HEV特异性抗原为HEV病毒基因组ORF?2和ORF?3重要抗原位点融合表达的戊肝抗原；b)荧光标记的三种二抗，其中三种二抗为针对人HEV?IgG、IgM、IgA抗体的二抗，所述的三种二抗标记的荧光基团各不相同；c)磷酸缓冲液。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王奕江，齐洁婷，刘明霞，王川，张必新，姚骅珊，沈靖，田茂生，
申请(专利权)人：苏州华益美生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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