一种快速分离纯化及富集派琴虫的方法技术

本发明专利技术涉及一种快速分离纯化及富集派琴虫的方法，所述方法包括如下步骤：（1）派琴虫免疫磁珠的制备；（2）分离纯化派琴虫；（3）荧光显微鉴定；（4）富集派琴虫。本发明专利技术还提供了所述方法在贝类样品派琴虫检测领域的应用。本发明专利技术所述方法对派琴虫感染样品具有较好的敏感性和特异性，可以检测到派琴虫感染样品中极少量的派琴虫，并能有效地将派琴虫从感染样品中分离纯化及富集出来。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及环境监测及免疫诊断领域，特别涉及一种对贝类样品中派琴虫的快速分离纯化及富集的方法。
技术介绍
派琴虫是世界动物卫生组织(OIE)规定的必报水生动物疾病之一。目前在世界范围内广泛流行，对世界水产品生长繁殖带来了极大的危害，并对水产品养殖及贸易造成了严重的经济损失。2008年农业部首次将派琴虫病列入了蛤仔主要感染的寄生虫病。吴绍强等于2008年5月至2009年5月期间对我国东部沿海一带(其中包括青岛、山东、宁波和福州等监测点)的监测点海域采集菲律宾蛤仔，并对派琴虫感染情况进行调查，结果显示蛤仔派琴虫的感染率在43.75%-95.83%之间不等，几乎每只蛤仔体内都有派琴虫的感染(Shao-qiang ffu, Ca1-xia Wang, Xiang-mei Lin, et al.1nfection Prevalence andPhylogenetic Analysis of Perkinsus olseni in Ruditapes philippinarum from EastChina.Diseases of Aquatic Organisms，2011，96 (I):55-60)。鉴于派琴虫对水产品危害的严重程度，国内外开展了很多的研究工作。梁玉波等于2001年应用巯基醋酸盐培养基(FTM)培养法成功培养派琴虫(梁玉波.菲律宾蛤仔体内寄生帕金虫的研·究.大连:中国科学院海洋研究所.2005.1-131)。目前，OIE规定为“黄金标准”的检测方法是巯基醋酸盐培养基(FTM)培养法，该方法被广泛地应用于派琴虫的鉴定中，但是此类方法操作过程耗时过长，敏感性较低，只有当每克组织虫体数大于IO3个时方可检出虫体(Uchida E, Kogi M.0ptimization of the virusconcentration method using polyethyIeneimine-conjugated magnetic beads and itsapplication to the detection of human hepatitis A, B and C viruses.J VirolMethods, 2007, 143(1):95-103.)。另外，派琴虫还有其它一些检测方法，如普通PCR、荧光PCR、原位杂交、组织切片以及环介导等温扩增(LAMP)等方法，感染率低的贝类样品极易出现假阴性。因此，研究一种快速分离纯化、富集及鉴定派琴虫的方法对我国贝类养殖则显得十分重要和迫切。磁性微球(Magnetic microspheres, MMS)是一种新型的功能材料,它通常由具有磁性的内核及核外包裹的高分子外壳两部分组成。磁性微球可与抗体、抗原、核酸等偶联，在反应体系中识别相应的抗原、抗体和核酸，从而达到分离或检测的目的。免疫磁性分离技术(Immunomagnetic Separation, IMS)是以抗体包被的磁珠为载体,通过抗体与反应介质中特异性抗原结合形成抗原-抗体复合物，此复合物在磁场的作用下定向移动，从而分离抗原。免疫磁性分离技术具有分离样品速度快、特异性强、操作简单、不需要昂贵的仪器设备等特点，而且不影响被分离细胞或其它生物材料的生物学性状和功能，目前已在医学和生物学的许多方面发挥了重要作用，尤其是在分离及鉴定病原体方面应用广泛。激光扫描共聚焦显微镜(LaserScanning Confocal Microscope, LSCM)工作原理为同屏采集显示3个不同发射波长的荧光色及I个混合色图像，对研究2种及2种以上物质的共存有明显优点。在显微镜的载物台上加一个微量步进马达控制载物台的升降，最小步进距离为0.Ιμπι，使焦平面依次位于标本的不同层面上，可以逐层获得标本的各个光学横断面的图像，实现“光学切片”的目的。通过不同的焦平面产生的光学切片，可得到一块较厚标本的三维图像，这是LSCM最重要的作用之一。将存储在计算机中的光学切片的焦平面信息结合起来，即可描述该标本的三维图像。目前LSCM最大有效解析厚度为0.45mm，扫描最小距离为0.1 μ m。吖啶橙是最经典的灵敏的荧光染料，它可通过与DNA和RNA的连接碱基对和磷酸盐基团结合，使细胞中的DNA和RNA同时染色而显示不同颜色的荧光。吖啶橙在稀溶液中呈绿色；在浓溶液中，由于出现二聚体和多聚体而呈现橙红色。由于DNA是高度聚合物，吸收荧光物质的位置较少，故发绿色荧光；而RNA聚合度低，能和荧光物质结合的位置多，故发红色荧光。在荧光显微镜下，细胞核DNA为黄绿色均匀荧光，细胞质和核仁的RNA为桔黄或桔红色荧光。因此，结合以上各技术研究出一种快速分离纯化、富集及鉴定派琴虫的方法，对我国贝类养殖则显得十分重要和迫切，其能够对新鲜贝类及加工食品快速诊断和检测提供技术支持。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种派琴虫免疫磁珠及其制备方法。本专利技术的另一目的是提供，所述方法灵敏度高，可以检测到贝类样品及加工食品中极少量的派琴虫。本专利技术的又一目的是提供所述快速分离纯化及富集派琴虫的方法在贝类样品派琴虫检测领域的应用。本专利技术提供 了一种派琴虫免疫磁珠的制备方法，所述方法为将派琴虫单克隆抗体与磁珠共价结合，通过包被和洗涤获得派琴虫免疫磁珠。具体地，所述方法包括如下步骤:(I)取 5mg Dynabeads M_270beads (6-7 X IO7 个/mg)于 1.5mL 的新离心管中，力口入ImL Cl悬浮磁珠；(2)磁力收集磁珠，弃上清；在离心管中加入(250-V。)μ L Cl悬浮磁珠，待用；(3)在磁珠悬液中加入VtlU L派琴虫细胞壁特异性单克隆抗体，混匀；再加入250 μ L C2，混匀；(4)将悬液在 37°C，IOOOrpm 下孵育 20 25h ；(5)孵育完毕，磁力收集磁珠，弃上清，分别用HB、LB及SB各洗涤I次，SB再重复洗漆磁珠I次，洗漆完毕后收集磁珠，在磁珠中加入800 μ LSB,室温，IOOOrpm下吸附15min ；(6)吸附完毕，用500 μ L SB重悬磁珠，此溶液即为派琴虫免疫磁珠溶液。所述派琴虫免疫磁珠溶液在4°C保存。优选地，步骤(3)中在磁珠悬液中加入30 μ L派琴虫细胞壁特异性单克隆抗体，所述抗体浓度为1.5mg/mL。优选地，步骤(6)中派琴虫免疫磁珠溶液的终浓度为9 μ gMcAb/mg beads。本专利技术还提供了所述方法制备的派琴虫免疫磁珠。本专利技术还提供了，所述方法包括以下步骤:( 1)派琴虫免疫磁珠的制备；(2)分离纯化派琴虫:所述派琴虫免疫磁珠与派琴虫进行特异吸附；将派琴虫与派琴虫样品中其它物质分离，获取纯化的派琴虫抗原抗体复合物与磁珠的结合物；(3)荧光显微鉴定:派琴虫抗原抗体复合物与磁珠的结合物通过吖啶橙染色，荧光显微镜检，观察分离效果；(4)富集派琴虫:当呈阳性反应时，将派琴虫抗原抗体复合物与磁珠的结合物在低盐低PH环境下分离磁珠与派琴虫抗原抗体复合物，获取富集后的派琴虫。其中，步骤(1)派琴虫免疫磁珠的制备参见前述制备派琴虫免疫磁珠的方法。优选地，步骤(2)包括如下步骤:(Al)制备好的免疫磁珠用pH为7.4的PBS洗涤一次后恢复原体积，备用；(A2)取派琴虫悬液200 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种派琴虫免疫磁珠的制备方法，其特征在于，所述方法为将派琴虫单克隆抗体与磁珠共价结合，通过包被和洗涤获得派琴虫免疫磁珠。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：邓俊花，吴绍强，林祥梅，冯春燕，王彩霞，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：