本发明专利技术涉及一种从产河豚毒素的细菌发酵液中制备降解河豚毒素的物质的方法和提取液的制备检测方法，包括人工造成质粒丢失的方法、河豚毒素降解物质的提取方法、降解河豚毒素的检验方法。在本发明专利技术中，首次发现气单胞菌Aeromonas?molluscorum中存在降解河豚毒素的物质，并建立了提取该物质的抽提方法，该方法有望用于降解河豚毒素物质的规模化生产。本发明专利技术涉及的细菌发酵液的抽提物具有降解河豚毒素的作用，可应用于制备用于治疗河豚毒素中毒的药物，可为科学研究、医药行业等相关领域提供原料。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，具体涉及药用微生物开发和利用领域，更具体地涉及一种从细菌发酵液中制备可降解河豚毒素提取液的方法，以及由其提取得到的河豚毒素降解物质提取液。
技术介绍
河豚毒素(Tetrodotoxin, TTX),是一种氨基全轻基喹唑啉的生物碱,为一种毒性极强的神经毒素，通过特异性阻断细胞膜上的电压门控钠离子通道，造成全身麻痹、最终死于呼吸和回流衰竭。TTX中毒潜伏期很短，短至10-30min，长至3_6h发病，发病急，如果抢救不及时，中毒后最快的IOmin内死亡，最迟4-6h死亡。临床治疗只能依赖于催吐、洗胃、导泻等减少毒物的吸收的方法，以及使用肾上腺皮质激素，提高组织对毒素的耐受性。目前尚无有效的解毒剂。目前已有通过制备河豚毒素抗体来阻断河豚毒素与其受体钠离子通道的研究报道，但还没有发现存在直接降解河豚毒素的药物。
技术实现思路
本专利技术发现，I株产TTX的细菌不但能合成河豚毒素，而且其发酵液中同时存在降解河豚毒素的物质。本专利技术的主要内容是:通过人工丢失产TTX细菌的质粒，使其失去产TTX的能力但却可以保留生产降解TTX的物质，通过抽提失去质粒的细菌发酵液，可获取降解河豚毒素的物质。本专利技术提供了人工造成质粒丢失的方法、质粒丢失的检测方法、以及降解河豚毒素物质的制备方法。降解河豚毒素物质可用作河豚毒素中毒的解毒药的开发和相关的科学研究。本专利技术的一个目的在于提供一种提取降解河豚毒素的物质的方法，包括如下步骤:(I)将质粒丢失的产河豚毒素的细菌发酵培养至少48小时(优选48-66小时，更优选67-96小时)，离心收集细胞，优选在4°C下4000 Xg离心30min后收集细胞；(2)用0.1%-1%乙酸(优选用1%的乙酸)溶解细胞，超声波破碎细胞；(3)95-105°C (优选100°C )煮20_25min，冷却后离心去除细胞碎片；(4)过滤上清；(5)对过滤液过活性碳柱，洗脱液的配方为:甲醇:1%的乙酸溶液=20:80 ； (6)洗脱液在40-50°C (优选45°C )减压浓缩，冷冻干燥；(7)溶于无菌去离子水中；(8)过 Bio-Gel P2 柱子；(9)用0.02-0.05M (优选0.03M)乙酸洗脱，收集洗脱液；(10)洗脱液再用 C18Sep_Pak cartridges 过柱；(11)用5-20 ml0.3%的乙酸洗脱，优选用IOml0.3%的乙酸洗脱，收集洗脱液；(12)将洗脱液过滤；(13)过滤液冷冻干燥后，溶解在无菌去离子水中，得到降解河豚毒素的物质的提取液。在一实施方式中，本专利技术所述的方法进一步包括以下检测步骤:将滤液作为待测样本,调整pH值为6.5-7.4，用ELISA法检测样本中的河豚毒素。在一实施方式中，本专利技术的提供一种提取降解河豚毒素的物质的方法，包括如下步骤:(I)将质粒丢失的产河豚毒素的细菌发酵培养至少48小时，4°C下4000Xg离心30min收集细胞；(2)用0.1%乙酸溶解细胞，超声波破碎细胞；(3) 100°C煮20_25min，冷却后离心去除细胞碎片；(4)过滤上清；(5)对过滤液过活性碳柱，洗脱液的配方为:甲醇:1%的乙酸溶液=20:80 ；(6)洗脱液在45 °C减压浓缩，冷冻干燥； (7)溶于2ml无菌去离子水中；(8)过 Bio-Gel P2 柱子；(9)用0.03M乙酸洗脱，从洗脱液流出开始收集,收集2ml ；(10)洗脱液再用 C18Sep_Pak cartridges 过柱；(11)用IOml0.3%的乙酸洗脱，从第二个柱体积洗脱液流出开始收集，收集两个柱体积的洗脱液；(12)将洗脱液过滤；(13)过滤液冷冻干燥后，溶解在Iml无菌去离子水中；(14)将滤液作为待测样本，调整pH值为6.5-7.4，用ELISA法检测样本中的河豚毒素。在本专利技术的一实施方式中，所述气单胞菌可以是软体动物气单胞菌(Aeromonas molluscorum),也可以是其它产河豚毒素的气单胞菌，例如来自假单胞菌属(Pseudomonas)、希瓦氏菌(Shewanella)、交替单胞菌(Alteromonas)、芽抱杆菌(Bacillus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、产喊菌属(Alcaligenes)、黄杆菌属(Flavobacterium)、邻单胞菌属(Plesiomonas)、沙雷氏菌属(Serratia)、拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)、微球菌属(Micrococcus)、莫拉菌属(Moraxella)、弧菌属(Vibrio)、放线菌(Actinomycetes)、柄杆菌属(Caulobacter)等类群的产TTX细菌。在本专利技术的一实施方式中，造成所述的产河豚毒素的细菌丢失质粒的人工发酵培养方法，包括如下步骤:( I)将所述的产河豚毒素细菌接种在添加精氨酸的ORI液体培养基中；(2)20-280C (优选23°C )下，200-450转/分钟(优选225转/分钟)，至少培养48小时。在本专利技术的一实施方式中，所述ORI液体培养基的组成为:0.05%精氨酸，0.2%胰蛋白胨，0.2 %大豆蛋白胨，0.1 %酵母抽提物，0.088 %柠檬酸铁，3 % NaCl，余量为蒸馏水，PH7-8.5 (优选 pH8.0)。在本专利技术的一实施方式中，所述ORI液体培养基的制备方法(IOOOml):在800ml去离子水中加入2g胰蛋白胨(0X0ID公司)，2g大豆蛋白胨(0X0ID公司)，Ig酵母抽提物(OXOID公司)，30g氯化钠(宜兴市第二化学试剂厂)和0.5g L-精氨酸(国药集团化学试剂有限公司)，搅拌溶解后，再加入0.88g柠檬酸铁(国药集团化学试剂有限公司)，继续搅拌，直到完全溶解后，加入去离子水定容至1000ml，并调节PH至7-8.5 (优选PH8.0)后封口灭菌。在本专利技术的一实施方式中，所述的检测步骤中的ELISA法检测包括如下步骤:(I)在固定有抗原的酶标板上分别加入TTX标准品，待测样本和添加了 TTX标准品的待测样本；(2)在酶标板上加入TTX的特异性抗体溶液；(3) 20-400C (优选室温或37°C )孵育至反应完全，加入洗涤液洗涤酶标板3次；(4)加入酶标二抗，20-40°C (优选室温或37°C )孵育至反应完全，加入洗涤液洗涤酶标板3次；(5)加入显色液，37°C孵育10_15min后，每孔加入终止液以终止反应；(6)结果检测:将酶标板插入酶标仪中,检测450nm处的吸光值。在本专利技术的一实施方式中，所述ELISA法的步骤(I)中，添加了 TTX标准品(Sigma-Aldrich公司，产品号:T8024_1MG)的待测样本，其TTX标准品添加终浓度为25_200ng/mL。 在本专利技术的一实施方式中，所述ELISA法的步骤(2)中的特异性抗体为TTX的特异性单抗(北京中卫食品卫生科技公司，产品号:5561)。在本专利技术的一实施方式中，所述ELISA法的步骤(3)中，孵育至反应完全所需时间为1.5h ;所述ELISA法的步骤(4)中孵育至反应完全为lh。本专利技术的另一目的在于提供一种造成产河豚毒素的气单胞菌丢失质粒的人工发酵培养方法，包括如下步骤:(I)将产河豚毒素的气单胞菌接种在添加精氨酸的ORI液体培养基中；(本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种提取降解河豚毒素的物质的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将质粒丢失的产河豚毒素的细菌发酵培养至少48小时，离心收集细胞；(2)用0.1%?1%乙酸溶解细胞，超声波破碎细胞；(3)95?105℃煮20?25min，冷却后离心去除细胞碎片；(4)过滤上清；(5)对过滤液过活性碳柱，洗脱液的配方为：甲醇：1%的乙酸溶液=20：80；(6)洗脱液在40?50℃减压浓缩，冷冻干燥；(7)溶于无菌去离子水中；(8)过Bio?Gel?P2柱子；(9)用0.02?0.05M乙酸洗脱，收集洗脱液；(10)洗脱液再用C18Sep?Pak?cartridges过柱；(11)用5?20ml0.3%的乙酸洗脱，收集洗脱液；(12)将洗脱液过滤；(13)过滤液冷冻干燥后，溶解在无菌去离子水中，得到降解河豚毒素的物质的提取液。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：鲍宝龙，卢瑛，马廷龙，赵静，刘静，张莉君，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：
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