本发明专利技术属于基因工程疫苗领域，具体涉及一种鸡毒害艾美耳球虫配子体抗原基因、表达及其表达产物的应用。该基因的开放阅读框大小为561bp。将其构建为原核表达载体pET28a-Engam22，转化BL21宿主菌后诱导表达。表达产物能被鸡康复血清所识别，显示重组蛋白有免疫原性。该基因构建的重组真核表达质粒pcDNA3.1-Engam22免疫雏鸡，能诱导产生体液免疫与细胞免疫，显示该基因能用于鸡球虫基因工程疫苗的研制。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及毒害艾美耳球虫(Eimeria necatrix)的配子体抗原基因，由所述基因编码的多肽，含有所述基因的载体以及所述基因的获取方法和多肽的体外表达方法以及功能鉴定。具体地，本专利技术的基因来自于鸡毒害艾美耳球虫有性生殖阶段的配子体。
技术介绍
鸡球虫病是由艾美耳属的一种或数种球虫寄生在鸡小肠或盲肠黏膜内引起的严重危害养鸡业的原虫病，估计每年全球因球虫病的损失为30亿美元。我国每年仅抗球虫药的年消费就约6 18亿元人民币，由鸡球虫病造成的直接和间接经济损失则难以估计。长期以来，鸡球虫病的防治主要依赖药物。但由于球虫对药物普遍产生了耐药性，引起药效下降。而且在鸡饲养周期中长期添加药物还导致药物残留肉蛋，直接危害人类健康，并污染环境。为此，鸡球虫病的防治方法由化学预防转向了免疫预防。目前，临床上用于免疫预防鸡球虫病的疫苗有活虫苗和由天然蛋白组成的亚单位疫苗两大类。虽然鸡球虫病活疫苗有着较强的免疫效果，但存在着如扩散病原的风险、球虫虫株的抗原变异、致弱虫株毒力易返强、疫苗接种剂量难以控制、疫苗影响饲料报酬、生产成本高、免疫程序繁琐、操作和免疫后的监测和管理技术要求高等一些突出的问题。商品化的鸡球虫病亚单位疫苗是由来源于巨型艾美耳球虫配子体的三种纯化抗原(分子质量分别为230、82、56kDa)配制而成，用于干扰卵囊壁的形成，即阻断艾美耳球虫的有性生殖阶段，从而降低卵囊的产生与传播。由于该类疫苗的抗原需从配子体蛋白中经亲和柱分离纯化，配子体又需从感染鸡体的肠道上皮细胞中分离纯化，因此生产工艺复杂，成本高，难易满足生产需求。而利用基因工程技术大量生产该类抗原，可能是解决这一问题的最佳策略。但巨型艾美耳球虫配子体抗原gam82和gam56基因已受到专利保护。毒害艾美耳球虫是鸡球虫病的重要病原之一，主要发生在60日龄以上的鸡。由于在鸡球虫不同种间缺乏交叉保护性，毒害与柔嫩和巨型艾美耳球虫在寄生部位的竞争性，以及毒害艾美耳球虫繁殖力低等原因，因此在育雏阶段用疫苗免疫预防，往往不能控制鸡饲养后期由毒害艾美耳球虫引发的球虫病。从毒害艾美耳球虫配子体克隆配子体抗原基因，构建原核表达载体表达重组抗原。用毒害艾美耳球重组配子体抗原免疫饲养后期的鸡，防治毒害艾美耳球虫引发的球虫病。但迄今为止，国内外还没有相关基因序列及其重组表达的报道。
技术实现思路
本专利技术利用基因工程技术，克隆毒害艾美耳球虫配子体抗原基因Engam22，并将该基因转入工程菌进行表达，获得大量的重组抗原，并对重组抗原的特异性、免疫原性等进行深入研究，旨为研制鸡球虫重组配子体抗原疫苗奠定基础。本专利技术涉及毒害艾美耳球虫的 一种配子体抗原基因，其中，所述的基因全长为713bp，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。其中包含的开放阅读框大小为561bp (79-639bp)，其编码的氨基酸序列如SEQ IDN0.2所示。去除信号肽(前19个氨基酸)以后的序列如SEQ ID N0.3所示。:本专利技术涉及到一种表达载体pET28a，其含有所述配子体抗原基因。将分离得到的配子体抗原基因插入酶切位点，连接到原核表达载体pET28a中，常规转化肠杆菌BL21(DE3 )，构建基因工程菌，并诱导表达，对表达产物进行分离、纯化和复性。另外，本专利技术涉及到一种真核表达载体PCDNA3.1，其含有所述配子体抗原基因。将分离得到的配子体抗原基因插入酶切位点，连接到PCDNA3.1中，构建成核酸疫苗，并用淋巴细胞增殖试验和ELISA方法来评价免疫后鸡体的细胞免疫和体液免疫水平。作为优选的方案，具体操作是:I)从毒害艾美耳球虫配子体基因中分离gam22基因:常规方法分离纯化毒害艾美耳球虫配子体，用RNA提取试剂盒提取总RNA。设计特异性引物:上游引物:5，-ACCCCAAAATAAAATCAAAGGC-3，(SEQID N0.4)；下游引物:5，-CCATGAAGATCTCAGACGTAGC-3，(SEQID N0.5)。以配子体总RNA反转录得到的cDNA为模板，经过PCR条件的反复优化后，成功扩增出与预期结果相符且大小为713bp左右的特异性片段(图1)，命名为Engam22。将含有目的片段PCR产物经试剂盒纯化回收后，克隆到pGEM-T-easy载体中，得到pGEM-T-easy-Engam22。 2)原核表达载体的构建根据毒害艾美耳球虫gam22基因的ORF序列和质粒pET_28a酶切位点，去除gam22基因的信号肽后，设计I对特异性引物:上游引物F:5’-TCGGAATTCGACGGAGCACCTGAG-3’ (SEQ ID N0.6)，含 EcoR I 酶切位点和3个保护性碱基，下游引物R:5’-GCGAAGCTTTTAGTTGATGTCGGT-3’ (SEQ ID N0.7)，含 Hind III酶切位点和3个保护性碱基。以构建的pGEM-T-eaSy-Engam22载体为模板，成功扩增出与预期结果相符且大小为522bp左右的特异性片段(图2)，并将此片段连接到原核表达载体pET28a中，得到pET28a_Engam22。3)毒害艾美耳球虫gam22基因的高效表达，纯化，复性将构建好的原核表达载体pET28a_Engam22转化BL21宿主菌，IPTG诱导表达后，经过可溶性分析，发现此体外重组表达的蛋白以包涵体形式存在(图3)。重组蛋白的大量表达时，超生裂解释放包涵体后，尿素变性。变性蛋白通过含有HIS标签的N1-NTA亲和层析纯化后，分别在含有6M、4M、2M、IM尿素的透析液和OM尿素的PBS中各复性8h，最终通过PEG8000浓缩，收集蛋白，12%SDS-PAGE分析(图4)，4°C保存。4)体外重组表达蛋白的特异性和免疫原性检测将重组表达的蛋白经过western-blot分析,分别以抗HIS的单克隆抗体(图5)、鼠抗gam22的多克隆抗体(图6)和毒害艾美耳球虫卵囊三次免疫后鸡的康复血清(图7)为一抗，以检测重组蛋白的特异性和免疫原性。本专利技术还公开了所述Engam22基因在构建核酸疫苗中的应用。所述核酸疫苗的构建如下:根据Engam22基因的ORF序列和质粒pcDNA3.1的特性，设计I对特异性引物:上游引物Fl:5’-CCCAAGCTTATGAGGGCTATCCTAACCAC-3’(SEQ ID N0.8)，含 Hind III酶切位点和3个保护性碱基，下游引物Rl:5’-GCGGAATTCTTAGTTGATGTCGGTAAGCT-3’ (SEQ ID N0.9)，含 EcoRI酶切位点和3个保护性碱基。以构建的pGEM-T-eaSy-Engam22载体为模板，成功扩增出与预期结果相符且大小为579bp左右的特异性片段(图8)，并将此片段连接到质粒pcDNA3.1中，得到pcDNA3.1-Engam22。将构建好的重组质粒pcDNA3.1-Engam22进行Hind III和EcoR I双酶切鉴定(图9)，选取阳性克隆 测序，确定阅读框架正确后大量克隆重组质粒用于后续试验。对构建的核酸疫苗进行免疫原性分析，评价核酸疫苗免疫后鸡的细胞免疫与体液免疫水平，结果表明:免疫后pcDNA3.l_Engam22组的抗体水平显著高于未免疫组对照组和空质粒组；pcDNA本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种鸡毒害艾美耳球虫配子体抗原基因Engam22，其基因全长为713bp，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陶建平，刘丹丹，曹李琴，许金俊，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：
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