本发明专利技术提供了一种体外构建组织工程化神经的方法，采用三维微重力生物反应器，将种子细胞与神经导管在三维微重力环境下培养，培养条件为：将种子细胞悬液与神经导管放入注满完全培养基的旋转培养容器，细胞最终密度为1×106/ml，37℃CO2培养箱中培养，前24小时转速为10rpm，使细胞与神经导管充分接触，贴附；24小时后调整三维微重力生物反应器旋转速度，使神经导管悬浮于培养液中；培养7-14天后终止培养，即得到组织工程化神经。本发明专利技术方法可以使神经导管贴附的种子细胞数量更多且更均匀，有利于周围神经再生，采用皮肤源性前体细胞诱导分化的雪旺氏细胞更接近真正的雪旺氏细胞，更适合作为神经组织工程的种子细胞。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医学工程领域，具体涉及，特别涉及一种采用三维微重力生物反应器体外构建组织工程化神经的方法。
技术介绍
世界上每年由于车祸、锐器、枪弹等外伤而造成周围神经挤压、牵拉、挫裂损伤的病例很多，对于短距离的周围神经缺损，可以利用神经自身的弹性和曲度，进行无张力的断端一期缝合来修补缺损。当缺损超过一定距离，无法进行无张力缝合时，必须进行神经移植。目前临床上最常用的是自体神经移植，并且作为周围神经修复的金标准。但是自体神经来源有限，移植的神经与原有神经在形态及功能上有所差别，而且势必会造成供区的失神经支配。同种异体神经或异种神经移植更是受到免疫排斥反应的限制，难以在临床上广泛开展应用。八十年代末，组织工程概念的提出及飞速发展给神经替代物的构建开辟了新的方向。组织工程的核心就是建立细胞与生物材料的三维空间复合体，即具有生命力的活体组织，用以对病损组织进行形态、结构和功能的重建并达到永久性替代。运用带有种子细胞的组织工程化神经来修复周围神经损伤已经成为一个研究热点。过去的方法均是将各类神经支架材料先移植入动物体内，再向其内注入种子细胞，但是直接注射法存在种子细胞流失、细胞状态未知等诸多不稳定因素，很难标准化。因此，如何获取促再生能力强，构建条件标准化的组织工程神经成为研究的热点。通过组织工程技术在体外制备生物活性良好的组织工程神经并广泛应用于临床需要解决一系列技术和工艺问题，包括:种子细胞如何高效均匀接种于支架材料上、大体积组织工程神经中心供养、组织工程神经的最佳体外培养时间和方式等。因此，生物反应器的合理应用有望解决上述产业化问题，其中三维微重力旋转培养系统具有剪切力小、传质作用好等优点，绕水平轴旋转的生物反应器在一定转速下具备模拟微重力环境的特性。由于模拟微重力环境可使细胞、组织培养摆脱重力的影响，实现更接近体内生存环境的三维培养，可能更有利于种子细胞体外增殖，细胞间的物质交换、提高种子细胞密度、促进种子细胞分泌细胞外基质。研究表明，神经干细胞与去细胞基质在模拟微重力环境下实验表皮样组织重建。胎鼠肝细胞通过应用生物反应器促进肝组织以及血管的发育。同时采用该方法培养的组织工程骨具有较传统静置培养法和即刻构建法获得的组织工程骨具有更好的成骨活性。科技文献《运用组织工程学原理构建间充质干细胞的三维培养体系》(付文玉，路艳蒙，乔东访等，潍坊医学院学报，2003年第25卷第3期，169-172)将人间充质干细胞与和人发角蛋白模拟微重力条件下培养，结果表明模拟微重力条件有利于人间充质干细胞的三维培养体系的构建。科技文献《运用组织工程学原理构建许旺细胞三维培养体系》(黎志明，朱家恺，程钢等，中华显微外科杂志2001年2月第24卷第I期，33-35)对聚羟基乙酸细丝支架进行化学改性处理后再以层粘连蛋白进行生物学修 饰，模拟微重力条件下把原代许旺细胞悬液接种在支架材料上，观察许旺细胞的粘附生长情况。结果表明模拟微重力环境有利于构建许旺细胞的三维培养体系。目前微重力的作用机制尚未阐明，不同种类细胞对微重力的反应可能截然不同，且目前也没有文献对不同种类细胞在微重力下对结构复杂的支架贴附情况进行研究，因而开展不同种类细胞以及复杂结构支架的微重力三维培养的研究制备组织工程化神经，对临床神经缺损的修复具有指导性的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种体外构建组织工程神经的方法。特别是利用三维微重力生物反应器将种子细胞培养于支架材料上。本专利技术具体技术方案为: ，采用三维微重力生物反应器，将种子细胞与神经导管在三维微重力环境下的培养，其特征在于培养条件为:将种子细胞悬液与神经导管放入注满完全培养基的旋转培养容器，细胞最终密度为IX 106/ml，旋转式生物反应器放入370C CO2培养箱中，前24小时转速为lOrpm，使细胞与神经导管充分接触，贴附；24小时后逐步提高三维微重力生物反应器旋转速度，使神经导管悬浮于培养液中；培养7-14天后终止培养，即得到组织工程化神经。由于神经导管的规格(材质、长度、内径等)不同，使其悬浮于培养液中的转速也有所不同，且随着培养时间的延长，贴附与神经导管上的细胞的数量也在不断增加，因此需要灵活调整三维微重力生物反应器旋转速度，逐步提高转速使得神经导管悬浮于培养液中。一般而言，转速范围为18-25rpm。本专利技术所述种子细胞优选皮肤源性前体细胞诱导分化的雪旺氏细胞。本专利技术所述神经导管由丝素蛋白、壳聚糖、聚乙醇酸、聚己内酯、胶原、聚乳酸、明胶中的一种或几种制成。神经导管内部还可以含有纤维，所述纤维由丝素蛋白、壳聚糖、聚乙醇酸、聚己内酯、 胶原、聚乳酸、明胶中的一种或几种制成。优选神经导管是表面多孔的壳聚糖导管，导管内部含有聚乳酸-羟基乙酸共聚物纤维或蚕丝丝素纤维。本专利技术所述所述神经导管内外表面还可以包被有层粘连蛋白和/或多聚赖氨酸。本专利技术所述的方法具体包括如下步骤: (1)种子细胞的制备 方法参照文献 NATURE PROTOCOLS, 2006(1):2803-2812,简述如下:取新生 SpragueDawley大鼠皮肤组织，得到皮肤前体细胞球，传代纯化培养，将获得的皮肤前体细胞球机械分离，贴壁并诱导分化为雪旺氏细胞，将雪旺氏细胞体外扩增培养，冻存备用。 (2)神经导管的制备 神经导管可采用本领域技术人员常用的组织工程神经移植物，优选表面多孔的壳聚糖导管，如50-90%、孔径50-300 μ m的具有多孔结构、抗拉强度高的神经导管，管状本体内径为0.5-8mm，壁厚0.l_3mm。具体可参照专利申请号为CN201110324474.8，名为“组织工程神经移植物及其用途”中所述的方法制得。或者优选纳米纤维蚕丝丝素蛋白导管，具体可参照专利申请号为CN200910034583.9，公开号为CN101664346，名为“静电纺丝制备的人工神经移植物及其制备方法和专用装置”中所述的方法制得。或者优选使用表面多孔的壳聚糖导管外壳或纳米纤维蚕丝丝素蛋白导管外壳，导管内部充填入丝素蛋白纤维的复合型神经导管，丝素蛋白纤维的制备可参照专利申请号为CN200910034583.9，公开号为CN101664346，名为“静电纺丝制备的人工神经移植物及其制备方法和专用装置”中所述的方法制得，或者可使用市售聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)纤维(南通华利康医疗器械有限公司，N405)。纤维的数量根据导管的内径不同而有所不同，通常按照每毫米内径200根的比例放置。上述神经导管用层粘连蛋白(0.02mg/ml)及多聚赖氨酸(0.2mg/ml)混合液包被过夜备用。(3)种子细胞与支架材料在三维微重力环境下的培养 将步骤(I)制备的种子细胞悬液与步骤(2)制备的神经导管放入注满完全培养基的旋转培养容器，细胞最终密度为lX106/ml，三维微重力生物反应器放入37°C CO2培养箱中，前24小时转速为10转/分钟，使细胞与神经导管充分接触，贴附。24小时后逐步提高三维微重力生物反应器旋转速度，使神经导管能悬浮到培养液中。培养期间每三天换液，更换500ml储液瓶。培养7-14天后终止培养，即得到组织工程化神经。所述的实验操作均在无菌条件下完成。所述种子细胞的分离培养及体外扩增均采用相应领域公认的方法。本专利技术优本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种体外构建组织工程化神经的方法，采用三维微重力生物反应器，将种子细胞与神经导管在三维微重力环境下的培养，其特征在于培养条件为：将种子细胞悬液与神经导管放入注满完全培养基的旋转培养容器，细胞最终密度为1×106/ml，旋转式生物反应器放入37℃CO2培养箱中，前24小时转速为10rpm，使细胞与神经导管充分接触，贴附；24小时后逐步提高三维微重力生物反应器旋转速度，使神经导管悬浮于培养液中；培养7?14天后终止培养，即得到组织工程化神经。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：顾晓松，丁斐，薛成斌，杨宇民，顾芸，汤欣，朱慧，
申请(专利权)人：南通大学，
类型：发明
国别省市：
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