本发明专利技术属于细胞免疫治疗技术领域，具体涉及乙肝病毒X蛋白（HBx）基因修饰的抗肝癌全细胞疫苗。本发明专利技术所要解决的技术问题是提供能够治疗HBV相关性肝癌的新型基因修饰的抗肝癌全细胞疫苗。本发明专利技术的技术方案是一种HBx修饰的抗肝癌全细胞疫苗，该疫苗的活性成分包括经过肝癌抗原基因修饰的肝癌细胞，所述的肝癌抗原基因是HBx。本发明专利技术还提供了抗肝癌全细胞疫苗的制备方法。本发明专利技术的抗肝癌全细胞疫苗能靶向杀伤HBx阳性的肝癌细胞，表现出良好的抗肝癌效应。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于细胞免疫治疗
，具体涉及乙肝病毒X蛋白(HBx)基因修饰的抗肝癌全细胞疫苗。
技术介绍
全球每年新增肝癌患者62.6万，其死亡率排在恶性肿瘤死亡率的第三位；我国属肝癌高发区域，近年来其发病率呈逐年上升的趋势，我国肝癌发病率占全球的45%，居我国癌症发病率的第二位。肝癌恶性程度高，其患者自确诊后的平均6个月存活率不到50%，I年存活率为24%，5年存活率大约为10%。肝癌对放化疗不敏感，手术切除是肝癌首选的治疗方法，通过完整的清除肿瘤组织，达到治愈的目的。早期肝癌手术切除后一年生存率达80%以上，五年生存率达50%以上。但是中晚期肝癌的手术切除疗效除了与肿瘤大小和数目有关，还与肝脏功能、肝硬化程度、肿瘤部位、肿瘤界限、有无完整包膜、静脉癌栓和血管侵润及淋巴结转移等有非常密切的关系。从临床实践来看，包括进行术前化、放疗后能够施行完全肝癌切除手术患者比例不到肝癌总例数的10%。中晚期肝癌手术切术五年生存率依然很低。其他治疗方法包括射频消融、微波消融、高强度聚焦超声、动脉化疗栓塞、酒精注射、冷冻治疗、放疗、然而这些疗法不仅毒性严重，且通常也无明显疾病缓解或延长生存期效果。最近几年问世的索拉非尼等新型小分子靶向药物也仅只延长患者生存2 3个月，同时该药物价格较为昂贵，同时可能会伴有腹泻、皮疹、高血压、手足综合征等较严重不良反应，效果还需进一步评价。因此肝癌迄今尚还处于一种严重缺乏有效治疗药物的尴尬境地。近年来，随着分子生物学、免疫学和细胞生物学等学科的快速发展，以肿瘤免疫治疗、基因治疗为代表的肿瘤生物治疗有望成为继手术治疗、化疗和放疗后肝癌治疗的新手段。流行病学统计显示,慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染与肝癌的发生密切相关。HBV是嗜肝病毒家族的一员，其基因组为松散的部分双链环状DNA，编码四个开放阅读框。其中乙肝病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein, HBx)是由HBV基因组中最小的一个开放读码框编码，是一种多功能蛋白，广泛地参与病毒复制、转录调控、细胞转化、细胞凋亡和周期调控。临床研究表明，在80%HBV相关性肝癌组织中HBx表达呈阳性，而且HBx的长期表达在细胞的癌变转化中发挥着关键的作用。有研究证实，HBx序列上存在着能激活特异性CTL反应的抗原表位。因此，HBx作为免疫治疗有效的靶点，去激活特异性的CTL反应，加强机体的免疫来对抗肿瘤。利用HBx的多表位肽段构建的类病毒颗粒免疫小鼠，研究表明这种疫苗能够激发特异性的CTL对抗HBV相关性肝癌。用含HBx抗原的口服疫苗免疫小鼠，也能够激发强烈抗肿瘤免疫反应。之前的研究表明，腺病毒载体介导的HBx表达的DNA疫苗在动物体内激活CD8+T细胞介导的特异性的抗肿瘤免疫反应，能够有效的抑制肿瘤的生长。 由于肿瘤发病机理十分复杂，筛选到特异的肿瘤抗原极其困难，以肿瘤细胞为基础的全细胞疫苗的开发得以积极进行。肿瘤全细胞疫苗是将自身的肿瘤细胞或体外培养的异体同种的肿瘤细胞，经过物理因素(照射、高温)、化学因素(酶解)等灭活处理，改变或消除其致瘤性，保留其免疫原性，导入患者体内，诱导特异性的抗肿瘤免疫应答。虽然肿瘤细胞带有肿瘤的全部抗原，但是由于肿瘤细胞疫苗的免疫原性弱，难以引起较强的免疫反应。弗氏完全佐剂、卡介苗等免疫佐剂的使用极大地改善了这种情况。目前美国有多个肿瘤全细胞治疗性疫苗正处于各级临床试验阶段，FDA有望在近期完成对该类产品的审核批准。近年来，随着基因工程的进展，人们开始对肿瘤细胞进行基因修饰。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供能够治疗HBV相关性肝癌的新型基因修饰的抗肝癌全细胞疫苗。本专利技术的技术方案是一种抗肝癌全细胞疫苗，该疫苗的活性成分包括经过肝癌抗原修饰的肝癌细胞，所述的肝癌抗原基因是HBx。进一步的，所述的肝癌细胞还有免疫调节基因与HBx共同修饰。其中，所述的免疫调节基因为人IL-2、人IL-12、人IL-15或人IFN-Y。其中，所述的肝癌细胞为体外传代的人肝癌细胞系。其中，所述的肝癌细胞为灭活的细胞。其中，所述的HBx编码基因具有Seq ID N0.1所示的核苷酸序列。其中，所述的人IL-12编码基因具有Seq ID N0.2所示的核苷酸序列。本专利技术还提供了上述的抗肝癌全细胞疫苗的制备方法，包括如下步骤:用表达HBx或HBx/免疫调节基因的真核表达 载体感染肝癌细胞，灭活，即得。其中，所述的灭活方式优选为辐照灭活。具体的，上述的抗肝癌全细胞疫苗的制备方法包括如下步骤:将肝癌细胞培养至密度达70 80%时，用表达HBx或同时表达人HBx和免疫调节基因的真核表达载体感染肝癌细胞，感染复数MOI为20 50，培养I 2天后收集收集细胞置于辐照仪中进行辐照灭活，离心收集细胞，细胞沉淀用细胞冻存液重悬，置于_80°C或液氮备用。其中，所述的真核表达载体为复制缺陷型重组腺病毒载体。本专利技术还提供了上述疫苗在制备治疗肝癌的药物中的用途。其中，所述的肝癌为HBV相关性肝癌。进一步的，所述的HBV相关性肝癌为HBx阳性的HBV相关性肝癌。本专利技术还提供了上述抗肝癌全细胞疫苗的制备方法在制备治疗HBV相关性肝癌药物中的用途。本专利技术还提供了上述抗肝癌全细胞疫苗的制备方法在在HBV相关性肝癌靶向细胞免疫治疗中的用途。本专利技术中，HBx基因修饰的抗肝癌全细胞疫苗能靶向杀伤HBx阳性的肝癌细胞，表现出良好的抗肝癌效应。同时本专利技术首次将肝癌抗原HBx或联合人IL-12等具有免疫调节作用的细胞因子基因导入肝癌细胞制备成基因修饰的抗肝癌全细胞疫苗，用于HBV相关性肝癌的靶向细胞免疫治疗。利用病毒感染或质粒转染等方法使肝癌细胞表达HBx，然后用X射线进行辐照灭活，作为治疗性肿瘤疫苗来治疗肝癌。辐照的表达HBx肿瘤细胞可明显诱导体内的抗肿瘤免疫反应，而未经基因修饰的肿瘤细胞疫苗在一定程度也能诱导免疫反应。本专利技术为HBV相关性肝癌的靶向细胞免疫治疗提供了新的选择，具有良好的应用前景。附图说明图1.HBx修饰抗肝癌全细胞疫苗抗小鼠肝癌实验，小鼠肿瘤体积生长曲线；PBS代表空白对照组小鼠；Hepal-6代表未经任何修饰的小鼠肝癌细胞免疫的小鼠；Hepal-6/AdNull代表感染了空病毒的小鼠肝癌细胞免疫的小鼠；H epal-6/AdHBx代表感染了携带HBx基因的重组腺病毒的小鼠肝癌细胞免疫的小鼠。图2.HBx修饰抗肝癌全细胞疫苗免疫小鼠脾T淋巴细胞亚群分析，为三次免疫治疗后分离淋巴细胞，并用荧光染料标记CD4、CD8，流式检测。PBS代表来源空白对照组小鼠的脾淋巴细胞；Hepal-6代表来源未经任何修饰的小鼠肝癌细胞免疫的小鼠脾淋巴细胞；Hepal-6/AdNull代表感染了空病毒的小鼠肝癌细胞免疫的小鼠脾淋巴细胞；Hepal-6/AdHBx代表感染了携带HBx基因的重组腺病毒的小鼠肝癌细胞免疫的小鼠脾淋巴细胞。横坐标代表⑶8阳性T淋巴细胞的数量；纵坐标代表⑶4阳性T淋巴细胞的数量。图3.HBx修饰抗肝癌全细胞疫苗免疫小鼠淋巴细胞增殖活性分析，分离后的淋巴细胞被CFSE标记后，和刺激物共同孵育5天，流式检测并用FlowJo7.6.1进行分析。PBS代表来源空白对照组小鼠的脾淋巴细胞；H本文档来自技高网...
【技术保护点】
抗肝癌全细胞疫苗，其特征在于：该疫苗的活性成分包括经过肝癌抗原基因修饰的肝癌细胞，所述的肝癌抗原基因是HBx。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：程平，魏于全，杨莉，李玉华，文艳君，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：
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