本发明专利技术公开了一种检测肠出血性大肠杆菌O157:H7活菌的方法，本发明专利技术是要解决现有实时荧光PCR不能有效区分死菌和活菌，导致对致病菌风险的过高估计的问题。该方法先进行待检样本的前处理；然后处理后的液体样品中加入PMA，控制PMA终浓度为15-20μg/mL，常温下于暗处孵育，卤钨灯照射处理；提取处理后样本的基因组DNA；以提取的样本基因组DNA为模板，进行实时荧光PCR定量检测样本中的目标菌；荧光定量PCR所用的引物、荧光标记探针如SEQ?ID?NO.1所示。本发明专利技术的方法耗时短，约1.5小时即可完成，大大缩短了检测时间。可广泛用于食源性致病菌检测领域。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种大肠杆菌的检测方法，特别是涉及一种检测肠出血性大肠杆菌0157:H7活菌的方法。
技术介绍
肠出血性大肠杆菌0157:H7(E.coli 0157:H7)是与公共卫生有关的最重要的出血性大肠杆菌的血清类型，对环境抵抗力较强，耐酸耐低温，对热敏感，在自然界的水中可存活数周甚至数个月。肠出血性大肠杆菌感染是一种人畜共患病。凡是体内有肠出血性大肠杆菌感染的病人、带菌者和家畜、家禽等都可传播本病。肠出血性大肠杆菌0157:H7致病能力和对胃酸的抵抗力均较强，对细胞的破坏性大。人群普遍易感，但以老人和儿童为主，而且老人和儿童感染后症状往往较重。世界卫生组织已经0157:H7列入新的食源性疾病病原菌。目前，国内外检测肠出血性大肠杆菌0157:H7的方法主要有平板分离培养法和实时荧光PCR技术。平板分离培养法操作繁琐，检测结果误差大，检测周期长，无法在第一时间对肠出血性大肠杆菌0157:H7的发生状况进行掌握和控制。实时荧光PCR技术是根据荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)原理，设计相应的突光标记核酸探针，通过PCR反应对靶基因进行定性、定量分析的技术。实时荧光PCR技术具有特异性强、灵敏度高，可定量，无污染的优点，易于标准化和推广应用，在医学、军事、农业、科研等领域得到了广泛的应用，但由于在细胞死亡后DNA可继续存在一段时间，其检测结果并不能真正反映样品中死菌和活菌的数量。
技术实现思路
本专利技术针对现有实时荧光PCR不能有效区分死菌和活菌，导致对致病菌过高检测的问题，提供一种定性检测肠出血性大肠杆菌活菌0157:H7的方法，用以克服现有技术无法迅速鉴定出环境中肠出血性大肠杆菌0157:H7活菌的问题。本专利技术提供了一种定性检测肠出血性大肠杆菌活菌0157:H7活菌的方法，该方法首先利用叠氮溴化丙锭(propidium monoazide, PMA)共价结合待检样品中死菌的DNA,再提取样本DNA，通过实时荧光PCR检测样品中肠出血性大肠杆菌0157:H7活菌。本专利技术目的通过如下技术方案实现:一种检测肠出血性大肠杆菌0157:H7活菌的方法，包括以下步骤:(I)液体样本离心浓缩处理；用接种环沾取甘油管保存的待检样品菌液，在LB固体培养基上划线，于37°C恒温培养箱培养24h ;挑取单菌落接种于50mL液体LB培养基，370C，180rpm摇床培养至对数生长期；用无菌LB培养基调整0D600值至1.0，其中菌浓度大于或等于109CFU/mL ;吸取ImL处于对数期的细菌培养液于1.5mL离心管中，在沸水浴中处理50s后立即置于冰上冷却，即为大肠杆菌热致死菌(2)向Iml大肠杆菌死菌浓度大于或等于109CFU/mL的液体样品中加入PMA，控制PMA终浓度为15-20 μ g/mL,常温下于暗处孵育，卤钨灯照射处理；(3)提取步骤(2)处理后样本的基因组DNA ；(4)以步骤(3)提取的样本基因组DNA为模板，进行实时荧光PCR定量检测样本中的目标菌，反应体系中引物终浓度为为5-15μπι01/1，探针终浓度为3-12 μ mol/L ;突光定量PCR所用的引物、荧光标记探针如SEQ ID N0.1所示。优选地，实时荧光PCR的反应程序为:95°C预变性2min，每个循环:95°C变性5s，60°C退火40s并收集FAM荧光，40个循环。暗处孵育的时间为5min，卤钨灯照射处理方法为:距离650W卤钨灯15cm照射5min。提取步骤(2)处理后样本的基因组DNA的方法包括酚/氯仿法、水提法或CTAB法。待检样本的不是液体样本时，还需在步骤(I)前将待检样本制成液体。本专利技术可应用于液体环境中肠出血性大肠杆菌0157:H7活菌的快速定性检测。待检样本的不是液体样本时，还需在步骤(I)前将待检样本制成液体。例如在无菌均质袋内，无菌操作剪碎25g固体样本于225mL灭菌LB液体培养基，利用高效自动均质器均质。吸取每个样品10mL,800rpm离心5min,除去固体样本碎片，上清液转移到新的离心管,8000rpm离心5min收集菌体并重悬于ImL无菌生理盐水。本专利技术步骤(I)对样本离心的目的在于对样本进行浓缩处理，获得较高的菌浓度，以便后续的操作。步 骤(3)提取出肠血性大肠杆菌0157:H7 DNA的方法可以是本领域所知的任何方法，包括但不限于酚/氯仿法、水提法、CTAB法等。步骤(4)荧光定量PCR所用的实时荧光PCR的反应程序为:95°C预变性2min，每个循环:95°C变性5s，60°C退火40s并收集荧光信号，40个循环。相对于现有技术，本专利技术具有如下优点:本专利技术以肠出血性大肠杆菌0157:H7为目标菌，建立了可定性检测肠出血性大肠杆菌0157:H7活菌的方法，通过I对特定的引物和I个荧光标记探针进行实时荧光PCR扩增，即可定性检测出样品中的肠出血性大肠杆菌0157:H7活菌，表现出快速、灵敏、特异性强的特点。本专利技术可排除高浓度死菌背景的干扰，实现对肠出血性大肠杆菌0157:H7活菌的检测，避免了假阳性的检测结果。本专利技术为半自动化操作，检测周期短。本专利技术方法的建立和应用，将缩短肠出血性大肠杆菌0157:H7活菌的检测周期，可为今后肠出血性大肠杆菌0157:H7活菌检测提供有力的技术支持。附图说明图1为实施例1荧光PCR检测结果曲线。A、B、C、D、E依次为PMA终浓度为0，5，10，15,20 μ g/mL样本的扩增曲线。随着PMA浓度的增大本专利技术以肠出血性大肠杆菌0157:H7为目标菌，建立了可定性检测肠出血性大肠杆菌0157:H7活菌的方法，通过I对特定的引物和I个荧光标记探针进行实时荧光PCR扩增，即可定性检测出样品中的肠出血性大肠杆菌0157:H7活菌，表现出快速、灵敏、特异性强的特点。本专利技术可排除高浓度死菌背景的干扰，实现对肠出血性大肠杆菌0157:H7活菌的检测，避免了假阳性的检测结果。本专利技术为半自动化操作，检测周期短。，PMA对死菌DNA的抑制作用增强。图2为具体实施方式2的检测结果。&、13、(3、(1、6依次为光照时间为0，1，2，3，51^11样本的扩增曲线。随着曝光时间增长，PMA对死菌DNA的抑制作用增强。曝光时间为5min或以上时可以完全抑制来自死菌的DNA的扩增。图3为具体实施方式3的检测结果。其中左侧为活菌经PMA处理后的扩增曲线，右侧为热灭活菌经PMA处理后的扩增曲线。热处理死菌经PMA处理后，经荧光PCR检测无典型扩增曲线，检测结果为阴性，活菌的扩增为典型的S型曲线。PMA可以结合热处理死菌的DNA，对活菌DNA无影响。 具体实施例方式为更好地理解本专利技术，下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步的说明，但是本专利技术要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。实施例1一种检测肠出血性大肠杆菌0157:H7活菌的方法，按照以下步骤进行:(I)待检样品的预处理:用接种环沾取甘油管保存的待检样品菌液，在LB固体培养基上划线，于37°C恒温培养箱培养24h。挑取单菌落接种于50mL液体LB培养基，37°C，180rpm摇床培养至对数生长期(0D600 ^ 1.0)。用无菌LB培养基调整0D600值至本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测肠出血性大肠杆菌O157:H7活菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)液体样本离心浓缩处理；用接种环沾取甘油管保存的待检样品菌液，在LB固体培养基上划线，于37℃恒温培养箱培养24h；挑取单菌落接种于50mL液体LB培养基，37℃，180rpm摇床培养至对数生长期；用无菌LB培养基调整OD600值至1.0，其中菌浓度大于或等于109CFU/mL；吸取1mL处于对数期的细菌培养液于1.5mL离心管中，在沸水浴中处理50s后立即置于冰上冷却，即为大肠杆菌热致死菌；(2)向1ml大肠杆菌死菌浓度大于或等于109CFU/mL的液体样品中加入PMA，控制PMA终浓度为15?20μg/mL，常温下于暗处孵育，卤钨灯照射处理；(3)提取步骤(2)处理后样本的基因组DNA；(4)以步骤(3)提取的样本基因组DNA为模板，进行实时荧光PCR定量检测样本中的目标菌，反应体系中引物终浓度为为5?15μmol/L，探针终浓度为3?12μmol/L；荧光定量PCR所用的引物、荧光标记探针如SEQ?ID?NO.1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：肖性龙，余以刚，李聪聪，吴晖，李晓凤，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：
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