本发明专利技术提供了一种快速简便富集微量动物组织线粒体DNA的方法，所述方法针对微量动物样品（最低10mg），通过碱性裂解法选择性沉淀核基因组DNA，经几步纯化后，达到快速简便富集线粒体DNA的目的。本发明专利技术的优势在于简便易行，实验耗时短，成本低廉，设备要求低，所富集的DNA可以直接作为后续利用PCR扩增进行分子鉴定的可靠模板，可用于小型鉴定实验室的微量动物样品预处理，特别适用于物种鉴定、个体分析以及古生物研究等。本发明专利技术可以适用于包括坚硬和柔软组织在内的几乎所有的微量动物组织。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种快速简便富集微量动物组织线粒体DNA的方法。
技术介绍
二十世纪中叶，随着DNA双螺旋模型的揭示和生物遗传密码的破解，生物学研究逐渐进入分子水平，加上核酸序列测定以及聚合酶链式反应(PCR)技术的专利技术和日趋成熟，基于DNA片段的扩增和序列分析的分子鉴定方法越来越受到人们的重视。线粒体DNA作为一种核基因组外的遗传信息携带者，由于其拷贝数量大、进化速度快、没有同源重组、分子结构稳定等特性受到分子鉴定学家们的青睐，特别适合于物种鉴定、个体分析以及古生物研究等方面。传统的线粒体DNA富集方法主要是依靠分级超速离心先分离出线粒体，再针对线粒体提取DNA，不仅样品需求量大且过程繁琐。目前最常用的方法是利用CTAB或者SDS法同时提取细胞核DNA和线粒体DNA，利用线粒体特异性引物扩增目的片段(如动物条形码标签coxl)，然而动物组织样品预处理中常常用到蛋白酶K消化很费时；此外硅胶膜离心柱法也是目前常用的商品化方法，缺点在于成本太高，不适合大规模样品的分析。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种线粒体DNA富集方法，起始组织用量少(最低可为10mg)，富集出的DNA可以作为后续PCR扩增分析的可靠模板。本专利技术采用的技术方案是:一种快速简便富集微量动物组织线粒体DNA的方法，所述方法包括:(I)取动物组织样品(最低10mg)，加入适量提取缓冲液，置于1.5mL离心管中，漩涡振荡器混合lmin，得混合液A ;所述裂解缓冲液为本领域常规用于组织提取的缓冲液；如果是较硬的动物组织如表皮、肌肉等，则需尽可能切成小块，置于研钵中，加入液氮研磨成粉末状，再置于离心管中进行提取；如果较软的组织如幼虫、胚胎、肝脏、神经等，则不需要进行研磨；(2)混合液A加入2倍体积碱性裂解液，颠倒混合30SeC，冰浴5min，得混合液B ；所述裂解缓冲液为本领域常规用于组织裂解的碱性裂解液；(3)混合液B加入1/2体积的3M醋酸钾溶液,颠倒混合30sec,冰浴IOmin,得混合液C ;(4)混合液C加入终浓度25 u g/mL的RNase A，37°C温浴Ihr后自然冷却至室温，12000 Xg以上离心10 15min,取上清液I移至新的1.5mL离心管；(5)上清液I中加入等体积的苯酚(pH8.0)，室温混匀5 lOmin，12000Xg以上离心10 15min,取上清液2移至新的1.5mL离心管；(6)上清液2中加入等体积的苯酚/氯仿体积比1:1的混合液，室温混匀5 IOmin, 12000 Xg以上离心10 15min,取上清液3移至新的1.5mL离心管；(7)上清液3中加入等体积的氯仿,室温混勻5 IOmin, 12000 Xg以上离心10 15min，取上清液4移至新的1.5mL离心管；(8)上清液4中加入1/10体积的3M醋酸钠和2倍体积无水乙醇，混匀，_20°C放置30min沉淀DNA，取沉淀即为富集的线粒体DNA，溶于适量样品溶解液，_20°C保存备用。所述样品溶解液为本领域常规用于DNA保存的溶解液。步骤(I)中所述提取缓冲液组成如下:0.1M NaCl,lmM EDTA, IOmM Tris-Cl，溶剂为水，ρΗ8.0。步骤(2)中所述碱性裂解液组成如下:1%SDS，0.2M NaOH，溶剂为水。步骤(8)中样品溶解液IOmM Tris-Cl，溶剂为水，pH8.5。在对于微量动物样品的分子鉴定分析过程中，可采用上述方法富集线粒体DNA，再按照下述方法进行进一步分析:(A)动物条形码标签coxl分析:利用动物coxl通用引物LC01490 (序列5’ -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’)和 HC02198 (序列 5’ -TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3，)，建立以下 PCR 反应体系(25 μ L):10mM Tris-Cl (ρΗ9.0), 50mM 氯化钾，1.5mM 氯化镁，0.l%TritonX-100, 四种 dNTP 各 200 μ M，两种引物各 0.4 μ Μ, 1.25U Taq DNA 聚合酶，并加入0.5 μ L上述方法制备的DNA模板。PCR反应条件为:94°C 5min, 38次循环(94°C 30sec,45°C 30sec,72°C 45sec),72°C IOmin0 所有 PCR 反应均在 Whatman-Biometra TGradient 基因扩增仪上进行。扩增获得的PCR产物按常规方法电泳检测、割胶回收、连接转化和序列测定。(B)动物线粒体16S rRNA基因片段分析:利用动物线粒体16S rRNA基因通用引物16Sar (序列 5，-CGCCTGTTTATCAAAAACAT-3，)和 16Sbr (5，-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3，)，建立以下PCR反应体系(25yL):10mM Tris-Cl (pH9.0)，50mM氯化钾，1.5mM氯化镁，0.l%TritonX-100,四种 dNTP 各 200 μ M，两种引物各 0.4 μ Μ, 1.25U Taq DNA 聚合酶，并加入0.5 μ L上述方法制备的DNA模板。PCR反应条件为:94°C 5min, 38次循环(94°C 30sec,45°C 30sec,72°C 45sec),72°C IOmin0 所有 PCR 反应均在 Whatman-Biometra TGradient 基因扩增仪上进行。扩增获得的PCR产物按常规方法电泳检测、割胶回收、连接转化和序列测定。线粒体DNA CmtDNA)呈双链环状，在动物中大小一般在15kb 18kb之内。本专利技术以罗氏沼虾(较硬的动物组织)和中华卤虫(较软的动物组织)为例，验证了本专利技术方法的可行性，因此本专利技术方法可适用于毫克级的各种动物来源样品，尤其适用于物种鉴定、个体分析以及古生物研究等。本专利技术涉及的线粒体DNA富集方法，优点在于快速简便，无需费时的蛋白酶处理过程，且起始组织用量少(最低10mg)，富集出的DNA可以直接作为后续利用PCR扩增进行分子鉴定的可靠模板，可用于小型鉴定实验室的微量动物样品预处理。相比较其他同类方法，简便易行，实验耗时短，成本低廉，设备要求低。附图说明图1为罗氏沼虾条形码标签coxl和16S rRNA基因片段的扩增电泳图；1、2分别为coxl和16S rRNA基因片段，M为IOObp分子量marker ；电泳条件为1.5%琼脂糖凝胶，100V ；图2为中华卤虫条形码标签coxl的扩增电泳图；1、2分别为两雌性个体，3、4分别为两雄性个体的coxl基因片段；电泳条件为1.5%琼脂糖凝胶，IOOV ；图3为中华卤虫16S rRNA基因片段的扩增电泳图；1、2分别为两雌性个体，3、4分别为两雄性个体的16S rRNA基因片段；电泳条件为1.5%琼脂糖凝胶，100V。具体实施例方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此:实施例1:罗氏沼虾肌肉组织动物条形码标签coxl和线粒体16S rRNA基因片段分析1.取一小块罗氏沼虾尾部肌肉，置于液氮中研磨至粉末状，取大约20mg组织样品粉末加入100 μ L提取缓冲液，漩涡振荡器混合Imin ；2本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种快速简便富集微量动物组织线粒体DNA的方法，所述方法包括：（1）取动物组织样品，加入适量裂解缓冲液，置于1.5mL离心管中，漩涡振荡器混合1min，得混合液A；（2）混合液A加入2倍体积碱性裂解液，颠倒混合30sec，冰浴5min，得混合液B；（3）混合液B加入1/2体积的3M醋酸钾溶液，颠倒混合30sec，冰浴10min，得混合液C；（4）混合液C加入终浓度25μg/mL的RNase?A，37℃温浴1hr后自然冷却至室温，12000×g以上离心10～15min，取上清液1移至新的1.5mL离心管；（5）上清液1中加入等体积的苯酚，室温混匀5～10min，12000×g以上离心10～15min，取上清液2移至新的1.5mL离心管；（6）上清液2中加入等体积的苯酚/氯仿体积比1:1的混合液，室温混匀5～10min，12000×g以上离心10～15min，取上清液3移至新的1.5mL离心管；（7）上清液3中加入等体积的氯仿，室温混匀5～10min，12000×g以上离心10～15min，取上清液4移至新的1.5mL离心管；（8）上清液4中加入1/10体积的3M醋酸钠和2倍体积无水乙醇，混匀，?20℃放置30min沉淀DNA，取沉淀即为富集的线粒体DNA，溶于适量样品溶解液，?20℃保存备用。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨劲树，俞炎琴，杨卫军，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：
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