本发明专利技术涉及一种真菌纤维素酶酶系组成/特性调控基因的应用。将里氏木霉中的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示的基因片段敲除后，插入尿苷筛选标记，然后经固态发酵后，制得高活性真菌纤维素酶系。本发明专利技术通过敲除盒取代该真菌纤维素酶酶活调控基因后，在固态发酵下，相比原初发菌株，外切葡聚糖甘酶比活力提高2.5倍，β-葡萄糖苷酶比活力提高3倍，调整了真菌胞外纤维素酶酶系，可以适用于不同领域的需求。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种真菌纤维素酶酶系组成/特性调控基因的应用，特别涉及一种在固态发酵培养下真菌纤维素酶酶系组成/特性调控基因的应用，属于基因工程
技术介绍
固态发酵是微生物在没有或基本没有游离水的固态基质上的发酵方式，固态基质中气、液、固三相并存，即多孔性的固态基质中含有水和水不溶性物质。与其他培养方式相t匕，固态发酵具有很多优点，因此，固态培养已经成为一种普适性的培养方法，在白酒、陈醋和产酶的生产工艺上应用较为成熟。真菌分泌的纤维素酶主要有外切葡聚糖苷酶，内切葡聚糖苷酶和β -葡萄糖苷酶，其中外切酶占大多数。自然界中植物光合作用产物的绝大部分是作为植物细胞壁组分的木质纤维素类物质，大约占生物质资源总量的80%以上，此外，每年农林废弃物和工业纤维性废渣也有上亿吨，而木质纤维素中纤维素主要以结晶状态存在，外切葡聚糖酶是唯一对结晶纤维素起作用的纤维素酶，在木质纤维素降解成还原糖的过程中，外切葡聚糖酶起着非常关键的作用。因此要更加充分利用自然界中广泛存在的纤维素资源，外切葡聚糖酶是不可缺少的。葡萄糖苷酶在其它方面也有重要作用，比如芳香植物中有许多以糖苷键合态形式存在的风味前体物质，通过β_葡萄糖苷酶的水解可以释放出其中潜在的芳香成分，从而可以增加植物芳香物，这对于天然香精香料工业有着重要意义(陈军杰(2005)。β_葡萄糖苷酶的液态发酵生产及其应用。江南大学)。在纤维素降解上，真菌分泌的纤维素酶液中β_葡萄糖苷酶酶活较低，通常导致纤维二糖的积累，致使其反馈抑制纤维二糖水解酶和内切酶的酶活，因此，若酶液中β -葡萄糖苷酶酶活提高，会降解纤维二糖解除这种抑制作用，从而促进纤维素的降解。(张裕卿，梁江华，李滨县(2007)，β_葡萄糖苷酶促进纤维素降解的应用，天津大学学报第40卷第3期317-320)。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，在固态条件下提供一种真菌纤维素酶酶系组成/特性调控基因的应用。本专利技术技术方案如下:一种核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示的真菌纤维素酶酶活调控基因在制备高活性真菌纤维素酶系中的应用。上述应用，将里氏木霉中的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示的基因片段敲除后，插入尿苷筛选标记，然后经固态发酵后，制得高活性真菌纤维素酶系。上述应用，具体步骤如下:将核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示基因片段转化入里氏木霉(Trichodermareesei)中，转化的同时敲除了里氏木霉中核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示的基因片段，制得转基因里 氏木霉，然后在固体培养基中，28 32°C培养4 6天，用pH4.8、浓度为0.05mol/L柠檬酸缓冲液浸泡菌体2 3h，经离心分离，取上清，制得高活性真菌纤维素酶系。根据本专利技术优选的，所述固体培养基组分如下，每十五克组分如下:麸皮2g，(NH4) SO40.5g, KH2PO4L 5g, MgSO40.06g, CaCl20.06g，微晶纤维素 2g，余量水。根据本专利技术优选的，所述里氏木霉(Trichodermareesei)为里氏木霉(Trichodermareesei) QM9414 Δ Ku70菌株，菌种保藏编号:26921,购自美国菌种保藏中心(ATCC)。根据本专利技术优选的，所述的离心，条件为12000rpm离心lOmin。有益效果本专利技术所述的真菌纤维素酶酶活调控基因可用于调控真菌中纤维素酶酶系，通过敲除盒取代该真菌纤维素酶酶活调控基因后，相比原初发菌株，在固态条件下培养，外切葡聚糖甘酶酶活和β -葡聚糖甘酶比酶活分别提高2.5倍和3倍，相较现有采用复配提高酶活的方法，更加方便，从而可以满足各行业对不同纤维素酶酶活的需求。附图说明 图1是实施例1制得的敲除盒的电泳图。其中:1、实施例1中里氏木霉(Trichodermareesei)QM9414 Λ Ku70当中构建的敲除盒，2、2kb Plus II Marker ；图2是实施例3得到的转化子验证示意图。图3是实施例3得到的转化子PCR验证图。其中:M:2kb Plus Marker, 1:利用 yzF和 yzR验证出发株 QM9414 Λ Ku70, 2:利用yzF和yzR验证转化子,3:利用mapkl和yzin R验证出发株QM9414 Δ Ku70,4:利用mapkl和yzin R验证转化子；图4是实施例3得到的转化子Southern blotting验证图。其中:M:2kb Plus Marker, 1:转化子条带，2:出发株 QM9414 Δ Ku70 ；图5是实施例4转化子与出发株固态发酵胞外酶液中β-葡萄糖苷酶比活力图。其中:T.reesei Λ tmk3表示转化株β _葡萄糖苷酶比活力，Τ.reesei表示出发株β-葡萄糖苷酶比活力；图6是实施例4转化子与出发株固态发酵胞外酶液中外切酶比活力图。其中:T.reesei Λ tmk3表示转化株外切酶比活力图,Τ.reesei表示出发株外切酶比活力具体实施例方式下面结合说明书附图及实施例对本专利技术的技术方案做进一步阐述，但本专利技术所保护范围不限于此。培养基麸皮培养基组分如下，均为重量百分比:10wt%麸皮浸出液，2wt%琼脂，余量水。基本培养基组分如下，每升组分如下:葡萄糖20g, (NH4) S045g, KH2P0415g, MgSO40.6g, CaCl20.6g, FeSO4.7H200.005g,MnSO4.H2O0.0016g, ZnSO4.7H200.0014g, CoCl20.002g，胰蛋白胨 IOg, ρΗ5.5。下层培养基组分如下，每升组分如下:葡糖糖20g, KH2PO415g, Sorbitol 182.1g,琼脂糖 IOg, I μ g/ml 的抗硫胺素，1.5%琼脂糖。上层培养基组分如下，每升组分如下:葡萄糖20g, (NH4) S045g, KH2P0415g, MgSO40.6g, CaCl20.6g, FeSO4.7H200.005g,MnSO4.H2O0.0016g, ZnSO4.7H200.0014g, CoCl20.002g,胰蛋白胨 IOg, Sorbitoll82.lg,I μ g/ml的抗硫胺素，1.5%琼脂糖。选择培养基组分如下，每升组分如下:葡萄糖20g, (NH4) S045g, KH2P0415g, MgSO40.6g, CaCl20.6g, FeSO4.7H200.005g,MnSO4.H2O0.0016g, ZnSO4.7H200.0014g, CoCl20.002g，胰蛋白胨 IOg, 1.5% 琼脂糖。所述固体培养基组分如下，每十五克组分如下:麸皮2g，(NH4) SO40.5g，KH2PO4L 5g，MgSO40.06g，CaCl20.06g，微晶纤维素 2g，余量水。生理盐水组分如下，均为重 量百分比:0.9wt%NaCl,0.5wt%吐温80。抽提缓冲液组分如下，组分如下:200mMTris-HCl, 250mmol/L NaCl, 25mmol/LEDTA, 2%十二烷基硫酸钠，pH8.5。菌株里氏木霉(Trichodermareesei) QM9414 Λ Ku70 菌株,菌种保藏编号:26921,购自美国菌种保藏中心(ATCC)本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示的真菌纤维素酶酶活调控基因在制备高活性真菌纤维素酶系中的应用。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王明钰，赵秋爽，方诩，侯少丽，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：
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