本发明专利技术公开了一种以乙二醇二缩水甘油醚和一种二元胺原酸酯单体(4’-二亚甲基氧-二-(2-氨基乙氧基-1，3-二氧戊烷)为骨架，按摩尔比1∶1-2的比例聚合而成，不同比例聚合可以获得不同支化程度的聚合物。此种聚合物具有支化结构，酸敏感、降解可控，细胞毒性低、转染效率高的特点。作为高效的基因载体在基因治疗中具有广泛的应用前景。通过比较不同支化程度的聚合物的性质(如DNA包裹能力和转染效果)，为以后的基因载体研究提供了宝贵的经验。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药、高分子医用材料
，具体涉及一类以乙二醇二缩水甘油醚及一种两端含氨基的原酸酯新单体为原料制备的具有支化结构的、酸敏感的阳离子聚合物的合成方法及应用。
技术介绍
基因治疗是一种全新的疾病治疗模式，是通过一定方式将正常基因或具有治疗作用的基因导入人体靶细胞进行适当表达，以纠正或改善疾病基因所产生的缺陷，达到治疗疾病的目的。随着基因治疗研究的不断深入，缺乏安全、有效的基因传递系统是制约基因治疗实施的一个主要瓶颈。所以，开发合适的载体，尤其是酸敏感的、具有胞内缓释性能的基因载体，使目的基因在靶细胞安全、可控及高效表达，是基因治疗能否成功的关键。基因治疗载体主要分病毒载体和非病毒载体。病毒载体具有较高的转染效率，但存在免疫原性高、毒性大、靶向特异性差等弊端，严重限制了它们在临床上的应用。非病毒载体主要是指带正电荷的阳离子基因载体，包括阳离子脂质体和阳离子聚合物，具有低毒、低免疫反应、无基因插入片段大小限制等优点。常见的阳离子聚合物如聚乙酰亚胺(PEI)、聚赖氨酸、壳聚糖、树装大分子等，通过静电作用与DNA形成聚电解质复合物，可有效缩合质粒DNA。但是，强烈的静电作用也限制了基因进入细胞液后从复合物中的释放，限制基因表达。细胞组件如细胞质、内涵体、溶酶体、内质网、高尔基体、线粒体、细胞核都维持独特的PH值(pH值从溶酶体的4.5到线粒体的8.0)。细胞内不同组分的pH值梯度及显著的理化性质的变化，具有酸敏感的基因转运体系将对基因的细胞内传递产生积极影响。因此，PH酸敏感聚合物载体，可以通过改变自身大分子构象、结构对外界微环境的刺激做出响应，可以有效解决常规聚合物载体对于DNA “包装易、拆解难”的弊端，应用前景良好。目前，聚乙酰亚胺PEI具有良好的DNA装载能力，及可促进DNA从内涵体逃逸至细胞质中的“质子海绵”特性，且转染效率高，是目前被研究的阳离子聚合物基因载体，有研究表明，PEI支化程度增加可以增强其包裹DNA的能力，但其不可降解，转染效率越高，细胞毒性也越大。本研究中合成的具有支化结构的阳离子聚合物，具有较强的包裹DNA能力，且细胞毒性低，其具备的酸敏感性能又使其具备较好的释放DNA的能力，能够满足临床的使用要求。并且，通过比较不同支化程度的基因载体，综合考察其性质(如DNA包裹能力，转染效果，细胞毒性，降解程度)等，为探寻最佳的基因载体提供可能。
技术实现思路
本专利技术的 目的在于提供一种合成的、具有支化结构的、酸敏感的、细胞毒性低、转染效率高的阳离子聚合物基因载体。该阳离子聚合物基因载体具有制备方法简单、成本低、细胞毒性低、安全实用、生物相容性好、可控的降解性能、基因转染效率高等优点。本专利技术的目的在于提供上述具有支化结构的、酸敏感的、细胞毒性低、转染效率高的阳离子聚合物基因载体的制备方法。该制备方法工艺简单，易于控制，成本低廉。本专利技术的目的在于提供上述阳离子聚合物在基因治疗中作为基因载体的应用。本专利技术的目的在于提供一种具有支化结构的、酸敏感的、细胞毒性低、转染效率高的阳离子聚合物基因载体，是以乙二醇二缩水甘油醚和一种二元胺原酸酯单体(4’ -二亚甲基氧-二 - (2-氨基乙氧基-1，3- 二氧戊烷)为骨架，按摩尔比1: 1-2的比例聚合而成。本专利技术提供的阳离子聚合物基因载体的制备方法包括以下步骤:取乙二醇二缩水甘油醚置于双颈瓶中，加入适量DMF，搅拌溶解后，向其中加入二元胺型原酸酯单体(乙二醇二缩水甘油醚:二元胺型原酸酯单体摩尔比=1-2: I)搅拌均匀，无水无氧室温条件下反应48h ;将反应产物装入截止分子量为3000-4000的透析袋中，蒸馏水(其中加入0.01%三乙胺)透析24-48h ;精确量取ImL透析产品冷冻干燥，即得支化程度不同的系列聚合物。本专利技术提供的阳离子聚合物由乙二醇二缩水甘油醚和二元胺原酸酯单体聚合物而成，在两者比例不同时，随着乙二醇二缩水甘油醚摩尔比的增大，聚合物由线性结构开始逐步交联(支化)，最终形成三维立体网状结构。聚合物中所含氨基带有正电荷，能够压缩DNA，形成纳米级的复合物，使其可以将核酸递送到细胞中。此聚合物中包含多胺及pH敏感原酸酯结构，具有微酸响应和降解可控的特点，使该聚合物作为基因载体可以使包裹的基因药物易于从内涵体和溶酶体中释放，有利于提高转染效率；其可降解性还使此聚合物具有良好的生物相容性，细胞毒性较不能 降解的PEI大大降低。本专利技术的聚合物既保留了和PEI相当的高转染效率，又大大降低了细胞毒性，且具备酸敏感和降解可控的特点。本专利技术提供了不同支化程度的聚合物，通过比较其性质，得出结论:支化程度越高对DNA包裹能力就越大,但细胞毒性也相应增大,转染效率也会降低，因此选择合适支化程度的聚合物才能获得最高的转染效率。附图说明图1为乙二醇二缩水甘油醚和二元胺原酸酯单体按照摩尔比为1: 1、1.5: I和2: I的比例合成得到的聚合物1、2、3的示意图。图2为MTT法测定聚合物1、2、3细胞毒性示意图；其中，图2-2为2-1的局部放大图；图3为聚合物1、2、3和DNA以不同质量比形成的复合物的凝胶电泳图；图4-1为聚合物1、2、3和DNA以不同质量比形成的复合物的粒径分析图；图4-2为聚合物1、2、3和DNA以不同质量比形成的复合物的电位分析图；图5为聚合物1、2、3和DNA以不同质量比形成的复合物的基因转染情况具体实施例方式下面通过实施例对本专利技术进行进一步说明。本专利技术不局限于如下实施例，在本专利技术权利要求所阐明的范围内，可对本专利技术进行各种改变和等同替换。实施例1具有支化结构的酸敏感阳离子聚合物基因载体的制备方法取乙二醇二缩水甘油醚0.283g置于双颈瓶中，加入ImL DMF，搅拌溶解后，向其中加入0.5g 二元胺型酸敏感单体(即乙二醇二缩水甘油醚:二元胺型酸敏感单体摩尔比=1: I)搅拌均匀，无水无氧室温条件下反应48h ;将反应产物装入截止分子量为3000-4000的透析袋中，蒸馏水(其中加入0.01%三乙胺)透析24-48h ;精确量取ImL透析产品冷冻干燥，称取冻干后的质量，即得到ImL透析溶液中聚合物的浓度。剩余量以液体形式冷冻保存。此聚合产物为聚合物I。取乙二醇二缩水甘油醚0.424g置于双颈瓶中，加入ImL DMF，搅拌溶解后，向其中加入0.5g 二元胺型酸敏感单体(即乙二醇二缩水甘油醚:二元胺型酸敏感单体摩尔比=1.5: I)搅拌均匀，无水无氧室温条件下反应48h;将反应产物装入截止分子量为3000-4000的透析袋中，蒸馏水(其中加入0.01%三乙胺)透析24-48h ;精确量取ImL透析产品冷冻干燥，称取冻干后的质量，即得到ImL透析溶液中聚合物的浓度。剩余量以液体形式冷冻保存。此聚合产物为聚合物2。取乙二醇二缩水甘油醚0.565g置于双颈瓶中，加入ImL DMF，搅拌溶解后，向其中加入0.5g 二元胺型酸敏感单体(即乙二醇二缩水甘油醚:二元胺型酸敏感单体摩尔比=2: I)搅拌均匀，无水无氧室温条件下反应48h ;将反应产物装入截止分子量为3000-4000的透析袋中，蒸馏水(其中加入0.01%三乙胺)透析24-48h ;精确量取ImL透析产品冷冻干燥，称取冻干后的质量，即得到ImL透析溶液中聚合物的浓度。剩余量以液本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种具有支化结构的酸敏感阳离子聚合物基因载体，其特征是为该阳离子聚合物基因载体以乙二醇二缩水甘油醚和一种二元胺原酸酯单体(4，4’?二亚甲基氧?二?(2?氨基乙氧基?1，3?二氧戊烷))聚合而成。这种二元胺原酸酯单体的结构为FSA00000885228800011.tif
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王睿，唐汝培，巩凯，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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