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基因分型DNA制造技术

技术编号:8982969 阅读:169 留言:0更新日期:2013-08-01 01:36
在本文描述的是对于检测核酸变异有用的组合物和方法。探针之内或探针之间的连接用于区别与靶完美互补的探针和含有错配的那些。根据实施的测定类型任选地应用核苷酸填充/延伸步骤。可将环化和再线性化步骤应用于创建用于进一步扩增和检测的模板。在特定方面,未扩增靶序列的部分或其补体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】基因分型DNA相关申请的交叉引用本申请要求2011年5月12日提交的美国申请N0.61/485,376和2010年8月11日提交的美国申请N0.61/372,849的优先权,全部通过引用合并。
在本文提供的是用于基因分型核酸的组合物和方法。
技术介绍
用于基因分型核酸的多种方法为本领域所知。Schon,美国专利N0.5,866,337 ;Landegren,美国专利N0.6,235,472 ;及Willis,美国专利N0.6,858,412提供其末端结构域与靶序列杂交的探针,产生与靶结合的开环探针。在特定条件下,连接发生在由探针和靶形成的杂交复合物的双链部分,导致探针和靶的连接。Willis另外地将切割位点合并到该文公开的前环探针。前环探针的闭合之后是切割和扩增,以产生包含地址位点的扩增子。Wi 11 i s中的扩增也包括与原靶同一或互补的序列的扩增。Shen,美国专利申请公开N0.2008/0242555和Oliphant,美国专利申请公开N0.2010/0015626描述用于同时扩增和/或基因分型各种样品的多重化方法。在这些参考文献中,用引物产生包括原靶序列的扩增产物,其包括基因组DNA。专利技术概述本文所述的组合物和方法对于核酸变异的检测有用。在特定实施方式中,未扩增靶序列的部分或其补体。在一些 实施方式中,拷贝或扩增部分靶序列或其补体。一方面,本专利技术提供鉴定一级靶序列中的检测核苷酸的方法,所述一级靶序列包含第I靶结构域,第2靶结构域及所述检测核苷酸,所述方法包括:(a)提供第I连接探针,其依次包含:(i)第I地址序列,(ii)第I引发结构域,(iii)第I杂交结构域,其互补于所述第I靶结构域及(iv)第I询问核苷酸;(b)提供第2连接探针,其依次包含:(i)第2杂交结构域,其互补于所述第2靶结构域及(ii)第2引发结构域,其中所述第I和第2连接探针之一包含切割位点;(c)使所述第I和第2连接探针分别与所述第I和第2靶结构域杂交,以形成杂交复合物;(d)使所述杂交复合物经历如果所述询问核苷酸与所述检测核苷酸完美互补,连接发生而形成连接的探针的条件;(e)自所述连接的探针形成环化的探针;Cf)在所述切割位点切割所述环化的探针以形成依次包含所述第2引发结构域,模板地址序列及所述第I引发结构域的二级靶序列;(g)使用所述二级靶序列上的所述引发结构域扩增所述模板地址序列以形成三级靶序列;及化)检测所述三级靶序列的存在以鉴定所述检测核苷酸。在一些实施方式中,所述环化的探针通过环化所述连接的探针来形成。在一些实施方式中,方法还包含提供第3连接探针,其依次包含:(i)第2地址序列,(ii)所述第I引发结构域,(iii)所述第I杂交结构域,其互补于所述第IIE结构域及(iv)第2询问核苷酸,其中所述第2地址序列不同于所述第I地址序列,及所述第2询问核苷酸不同于所述第I询问核苷酸。在一些实施方式中,所述环化的探针在所述连接发生时形成。在一些实施方式中,方法还包含提供第3连接探针,其依次包含:(i)第2地址序列,(ii)所述第I引发结构域,(iii)所述第I杂交结构域,其互补于所述第IIE结构域及(iv)第2询问核苷酸,其中所述第2地址序列不同于所述第I地址序列;所述第2询问核苷酸不同于所述第I询问核苷酸;选自所述第3连接探针及所述第2连接探针的探针包含切割位点;及所述第3连接探针及所述第2连接探针在所述第2地址序列和所述第2引发结构域之间接合。在一些实施方式中,所述第I地址序列具有不同于所述第2地址序列的尺寸的尺寸。在一些实施方式中,所述第I地址序列具有不同于所述第2地址序列的核苷酸序列的核苷酸序列。在一些实施方式中,该方法还包含使所述杂交复合物与至少一种dNTP和聚合酶在所述连接之前接触,其中所述第I连接探针的3’末端和所述第2连接探针的5’末端被所述杂交复合物中的至少一个核苷酸隔开。在一些实施方式中,所述第I连接探针的3’末端和所述第2连接探针的5’末端在所述杂交复合物中相邻。在一些实施方式中,方法还包括使所述杂交复合物与校正聚合酶和至少一种dNTP接触,其中所述第I连接探针包含3’延伸阻断部。在一方面,本专利技术中提供鉴定一级靶序列中的检测核苷酸的方法,所述一级靶序列包含第I靶结构域,第2靶结构域及所述检测核苷酸,所述方法包括:Ca)提供第I连接探针,其依次包含:(i)地址序列,(ii)第I引发结构域及(iii)第I杂交结构域,其互补于所述第I靶结构域;(b)提供第2连接探针,其依次包含:(i)第2杂交结构域,其互补于所述第2靶结构域及(ii)第2引发结构域,其中所述第I和第2连接探针之一包含切割位点;(c)在第I容器中使所述第I和第2连接探针分别与所述第I和第2靶结构域杂交,以形成杂交复合物;(d)使所述杂交复合物与第IdNTP和聚合酶接触,使得如果所述第IdNTP与所述检测核苷酸完美互补,所述第I或第2连接探针延伸而包含询问核苷酸;(e)使所述杂交复合物经历连接发生而形成连接的探针的条件;(f)自所述连接的探针形成环化的探针;(g)在所述切割位点切割所述环化的探针以形成依次包含所述第2引发结构域,模板地址序列及所述第I引发结构域的二级靶序列;(h)使用所述二级靶序列上的所述引发结构域扩增所述模板地址序列以形成三级靶序列;及(丨)检测所述三级靶序列的存在以鉴定所述检测核苷酸。在一些实施方式中,所述环化的探针通过环化所述连接的探针来形成。在一些实施方式中,所述环化的探针在所述连接发生时形成。在一些实施方式中,方法还包括重复所述方法,其中第2杂交步骤发生在第2容器中,及所述接触步骤包括使所述杂交复合物与第2dNTP和聚合酶接触,使得如果所述第2dNTP与所述检测核苷酸完美互补,所述第I或第2连接探针延伸而包含询问核苷酸,其中所述第2dNTP不同于所述第I dNTP。 在一些实施方式中,所述第I和第2靶结构域仅被所述检测核苷酸隔开。一方面,本专利技术提供鉴定一级靶序列中的检测核苷酸的方法,所述一级靶序列包含第I靶结构域,第2靶结构域及所述检测核苷酸,所述方法包括:(a)提供第I连接探针,其依次包含:⑴第I引发结构域,(ii)地址序列,(iii)第2引发结构域及(iv)第I杂交结构域,其互补于所述第I靶结构域;(b)提供第2连接探针,其包含:(i)第2杂交结构域,其互补于所述第2靶结构域及(ii)标记物;(c)在第I容器中使所述第I和第2连接探针分别与所述第I和第2靶结构域杂交,以形成杂交复合物;(d)使所述杂交复合物与第IdNTP和聚合酶接触,使得如果所述第IdNTP与所述检测核苷酸完美互补,所述第I或第2连接探针延伸而包含询问核苷酸;(e)使所述杂交复合物经历连接发生而形成二级靶序列的条件;(f)通过使标记物与附接于固体支持物的捕获结合配体结合来捕获所述二级靶序列;(g)使用所述二级靶序列上的所述引发结构域扩增所述地址序列以形成三级靶序列;及(h )检测所述三级靶序列的存在以鉴定所述检测核苷酸。在一些实施方式中,方法包括重复所述方法,其中第2杂交步骤发生在第2容器中,及所述接触步骤包括使所述杂交复合物与第2dNTP和聚合酶接触,使得如果所述第2dNTP与所述检测核苷酸完美互补,所述第I或第2连接探针延伸本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员:K·A·克鲁梅尔张海川A·S·卡茨R·巴尔多奇R·加蒂张毅K·冈宁E·涂
申请(专利权)人:赛路拉公司
类型:
国别省市:

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