一种检测黄曲霉毒素B1含量的非标记免疫分析方法技术

本发明专利技术涉及一种检测黄曲霉毒素B1含量的非标记免疫分析方法。它包括以下步骤：检测待测样品溶液在365nm激发波长激发下，加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11使黄曲霉毒素B1荧光充分淬灭前后的440nm处的荧光强度值，所述抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体由保藏号为CCTCCNO.C201013的杂交瘤细胞株1C11产生；基于预先获得的荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11淬灭强度与黄曲霉毒素B1浓度的关系曲线，由该待测样品溶液的荧光被抗体淬灭强度求得待测样品溶液中黄曲霉毒素B1的含量。该方法可用于直接定量检测黄曲霉毒素B1；操作简单快速；无需标记、检测成本低、污染危害小。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属生物检测领域，具体涉及一种检测黄曲霉毒素BI含量的非标记免疫分析方法。
技术介绍
黄曲霉毒素是一类结构类似的化合物，自然界中的黄曲霉毒素主要是由黄曲霉菌和寄生曲霉产生的次级代谢产物。目前发现的黄曲霉毒素有二十余种，其中以黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2和Ml最为常见。黄曲霉毒素能对人及动物的肝脏组织产生破坏作用，严重时可导致肝癌甚至死亡。黄曲霉毒素被世界卫生组织划定为I类致癌物，以黄曲霉毒素BI毒性最强，其毒性是砒霜的68倍。黄曲霉毒素可发生在热带或亚热带地区的农产品出产过程中，同时在储藏、运输等环节也可能引入黄曲霉毒素的污染。花生是最易发现有黄曲霉毒素的农产品，其他如玉米、无花果、果仁及谷物都有可能受黄曲霉毒素污染。由于我国小农户分散型的种植模式，农产品从农田到餐桌的各个环节都有可能受到黄曲霉毒素的污染。而黄曲霉毒素毒性大，危害严重，因此，世界各国对农产品中黄曲霉毒素的含量制定了严格的限量标准，成为控制农产品质量安全的关键环节。为了更有力地监测黄曲霉毒素含量，近年来分析检测黄曲霉毒素的技术逐渐增多，灵敏度也逐渐提高。主要有仪器分析方法和免疫分析方法。免疫学方法克服了仪器方法费用高、操作条件要求高、对环境污染大等缺点，具有快速、简便、特异性好、对操作人员和环境危害小等优点。基于免疫方法的试纸条层析技术和酶联免疫试剂盒已被广泛的应用于现场的定性和定量检测。试纸条层析技术可在15min内实现检测，但是只能进行定性分析，无法实现定量检测；酶联免疫试剂盒可进行定量检测，但是耗时需几个小时，操作步骤多。因此，研究建立一种简单、快速、灵敏、可定量检测黄曲霉毒素BI的方法对于快速、准确、在线监控农产品中黄曲霉毒素具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对上述现有技术存在的不足而提供一种检测黄曲霉毒素BI含量的非标记免疫分析方法。该方法可用于农产品中黄曲霉毒素BI检测，与常规荧光和酶标记免疫分析方法相比具有无需标记的特点。本专利技术为解决上述技术问题所采用的技术方案为:一种检测黄曲霉毒素BI含量的非标记免疫分析方法，其特征在于:包括以下步骤: (1)提供待测样品溶液，检测待测样品溶液在365nm激发波长激发下，加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll使黄曲霉毒素BI荧光充分淬灭前后的440nm处(荧光发射光谱中荧光强度最大处对应的波长)的荧光强度值，所述抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll由保藏号为CCTCC NO:C201013的杂交瘤细胞株ICll产生；(2)基于预先获得的荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll淬灭强度与黄曲霉毒素BI浓度的关系曲线，由该待测样品溶液的荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll淬灭强度值即加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll淬灭前后的440nm处的两个荧光强度的差值，求得待测样品溶液中黄曲霉毒素BI的含量。 该杂交瘤细胞株ICll已于2010年7月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC N0.C201013。按上述方案，所述的步骤(I)中黄曲霉毒素BI荧光充分淬灭后的440nm处的荧光强度值是在待测样品溶液中加入适量抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11，使加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11后的待测样品体系中抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll的浓度至少达到使体系中黄曲霉毒素BI的荧光充分淬灭的最小浓度，然后混匀，于37±5°C放置至少0.5h，再经365nm激发波长激发测试得到测得的。按上述方案，所述的荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll淬灭强度与黄曲霉毒素BI浓度的关系曲线是采用以下方法得到的: ①配制得到一系列浓度的黄曲霉毒素BI标准品溶液，在365nm激发波长激发下获得各浓度的黄曲霉毒素BI标准品溶液的荧光发射光谱，记录440nm处的荧光强度值； ②向上述各浓度的黄曲霉毒素BI标准品溶液中加入等量的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11，所述抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll由保藏号为CCTCC NO:C201013的杂交瘤细胞株ICll产生，使加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll后的各浓度的黄曲霉毒素BI标准品溶液体系中抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体的浓度至少达到使最大浓度黄曲霉毒素BI标准品溶液中的黄曲霉毒素BI的荧光充分淬灭的最小浓度，而使黄曲霉毒素BI荧光在抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll的作用下充分淬灭，然后在365nm激发波长激发下获取各加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll的黄曲霉毒素BI标准品溶液的荧光发射光谱，记录440nm处的荧光强度值； ③经拟合得到荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll淬灭强度与黄曲霉毒素BI浓度的关系曲线c (x,y)——X黄曲霉毒素BI浓度，y为荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll淬灭强度即加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体淬灭前后440nm处荧光强度的差值。按上述方案，所述步骤①中一系列浓度的黄曲霉毒素BI标准品溶液是将黄曲霉毒素BI的甲醇储备液稀释配制得到的，浓度分别为10、7.5、5、3.5、2、1.5、1、0.75,0.5、0.3,0.1 ng/mL ;所述各溶液的黄曲霉毒素BI标准品溶液中加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll后的溶液体系中抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll的浓度为>20 u g/mL，优选为 20 u g/mL。按上述方案，所述步骤①中的稀释液可为磷酸盐缓冲液，按下述方法配制:0.Sg氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钾，加水定容至lOOOmL。按上述方案，所述步骤②中为在各浓度的黄曲霉毒素BI标准品溶液中加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll加入后混匀，并于37±5°C放置至少0.5h以使黄曲霉毒素BI荧光被充分淬灭，然后进行后续步骤。按上述方案，所述步骤③为分段拟合，分别得到小浓度时荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll淬灭强度与黄曲霉毒素BI浓度的关系曲线C1 Cx1, Y1)——X1黄曲霉毒素BI浓度，0.1-1 ng/ml, Y1为荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll淬灭强度即加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体前后的440nm处荧光强度的差值，和大浓度时荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll淬灭强度与黄曲霉毒素BI浓度的关系曲线C2 U2, Y2)——X2黄曲霉毒素BI浓度，1-10 ng/ml, y2为荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll淬灭强度即加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体前后的440nm处荧光强度的差值； 相应地，在求算待测样品中黄曲霉毒素BI浓度时根据待测样品溶液中黄曲霉毒素BI的荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll淬灭强度确定选用小浓度时荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll淬灭强度与黄曲霉毒素BI浓度的关系曲线C1 Cx1, yi)，还是大浓度时荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体淬灭强度与黄曲霉毒素BI浓度的关系曲线C2(x2, y2)，然后结合该待测样品溶液的荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll淬灭强度值计算待测样品中黄曲霉毒素BI浓度。按上述方案，所述待测样品溶液中黄曲霉毒素BI的浓度应在该方法步骤(2)中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测黄曲霉毒素B1含量的非标记免疫分析方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）提供待测样品溶液，检测待测样品溶液在365nm激发波长激发下，加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11使黄曲霉毒素B1荧光充分淬灭前后的440nm处的荧光强度值，所述抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11由保藏号为CCTCC?NO：C201013的杂交瘤细胞株1C11产生；（2）基于预先获得的荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11淬灭强度与黄曲霉毒素B1浓度的关系曲线，由该待测样品溶液的荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11淬灭强度值即加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11淬灭前后的440nm处的两个荧光强度的差值，求得待测样品溶液中黄曲霉毒素B1的含量。

【技术特征摘要】
1.一种检测黄曲霉毒素BI含量的非标记免疫分析方法，其特征在于:包括以下步骤: (1)提供待测样品溶液，检测待测样品溶液在365nm激发波长激发下，加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll使黄曲霉毒素BI荧光充分淬灭前后的440nm处的荧光强度值，所述抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll由保藏号为CCTCC NO:C201013的杂交瘤细胞株ICll产生； (2)基于预先获得的荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll淬灭强度与黄曲霉毒素BI浓度的关系曲线，由该待测样品溶液的荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll淬灭强度值即加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll淬灭前后的440nm处的两个荧光强度的差值，求得待测样品溶液中黄曲霉毒素BI的含量。2.根据权利要求1中所述的检测黄曲霉毒素BI含量的非标记免疫分析方法，其特征在于:所述的步骤(I)中黄曲霉毒素BI荧光充分淬灭后的440nm处的荧光强度值是在待测样品溶液中加入适量抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11，使加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll后的待测样品体系中抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll的浓度至少达到使体系中黄曲霉毒素BI的荧光充分淬灭的最小浓度，然后混匀，于37±5°C放置至少0.5h，再经365nm激发波长激发测试得到测得的。3.根据权利要求1中所述的检测黄曲霉毒素BI含量的非标记免疫分析方法，其特征在于:步骤(2)所述的荧光 被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll淬灭强度与黄曲霉毒素BI浓度的关系曲线是采用以下方法得到的: ①配制得到一系列浓度的黄曲霉毒素BI标准品溶液，在365nm激发波长激发下获得各浓度的黄曲霉毒素BI标准品溶液的荧光发射光谱，记录440nm处的荧光强度值； ②向上述各浓度的黄曲霉毒素BI标准品溶液中加入等量的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11，所述抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll由保藏号为CCTCC NO:C201013的杂交瘤细胞株ICll产生，使加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll后的各浓度的黄曲霉毒素BI标准品溶液体系中抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体的浓度至少达到使最大浓度黄曲霉毒素BI标准品溶液中的黄曲霉毒素BI的荧光充分淬灭的最小浓度，而使黄曲霉毒素BI荧光在抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll的作用下充分淬灭，然后在365nm激发波长激发下获取各加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll的黄曲霉毒素BI标准品溶液的荧光发射光谱，记录440nm处的荧光强度值； ③经拟合得到荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll淬灭强度与黄曲霉毒素BI浓度的关系曲线c (x,y)——X黄曲霉毒素BI浓度，y为荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体ICll淬灭强度即加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体淬灭前后440nm处荧光强度的差值。4.根据权利要求3中所述的检测黄曲霉毒素BI含量的非标记...

【专利技术属性】
技术研发人员：李培武，李鑫，张奇，丁小霞，张文，张兆威，李冉，
申请(专利权)人：中国农业科学院油料作物研究所，
类型：发明
国别省市：