本发明专利技术属于对12种常见真菌的快速分类鉴定方法，具体地说是用傅立叶变换红外光谱(FTIR)技术结合化学计量学运算(分级聚类分析)对禾谷镰孢霉(F.graminearum)、栖土曲霉(A.terricola)、黄暗青霉(P.citreonigrum)、黄曲霉(A.flavus)、寄生曲霉(A.parasiticus)、桔灰青霉(P.aurantiogriseum)、拟康氏木霉(T.pseudokoningii)、土生链孢霉(A.humicola)、鲜绿青霉(P.viridicatum)、烟曲霉(A.funigatus)、杂色曲霉(A.uersicolor)、茄病镰刀菌(F.solani)等12种常见真菌进行分类鉴定。方法包括12种真菌FTIR光谱信息数据库的建立、真菌的培养、硒化锌(ZnSe)窗片的制作、光谱采集及预处理，最后采用分级聚类分析进行结果判定。其优点在于分辨率高、快速、操作简单、成本低。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于对12种常见真菌的快速分类鉴定方法，具体地说是用傅立叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy, FT-1R)技术对禾谷键抱霉(Fusariumgraminearum, F.graminearum)、栖土曲霉(Aspergillus terricola, A.terricola)、黄暗青霉(Penicillium citreonigrum, P.citreonigrum)、黄曲霉(Aspergillusflavuus, A.flavus)、寄生曲霉(Aspergillus parasiticus, A.parasiticus)、桔灰青霉(Penicillium aurantiogriseum, P.aurantiogriseum)、拟康氏木霉(Trichodermapseudokoningii, T.pseudokoningii)、土生链抱霉(A lternari a humicola, A.humicola)、鲜绿青霉(Penicillium viridicatum,P.viridicatum)、烟曲霉(Aspergillus funigatus,A.funigatus)> 杂色曲霉(Aspergillus versicolor, A.uersicolor)、爺病键刀菌(Fusarium solani, F.solani)进行快速分类鉴定。
技术介绍
真菌特别是植物病原真菌，种类繁多且分布广泛，是引起小麦、水稻、大豆、蔬菜、花卉等大田作物和园艺作物病害的重要病原物，病害的发生经常造成作物大面积减产和粮食品质下降，有些属能引起人类和一些动物皮肤病等。另外，一些真菌常产生剧毒的代谢产物，掺入植物性食品中，对人类健康危害较大，如黄曲霉毒素、赭曲霉毒素等，其会破坏人或动物的肝脏组织及免疫系统，具有较强的致癌性。如产黄曲霉毒素的黄曲霉菌、寄生曲霉，产赭曲霉毒素的曲霉菌属和青霉菌属等。因此快速准确地对这些真菌进行鉴定是防治植物病害和食品真菌毒素污染的重要技术手段。FT-1R技术以未损伤细胞的FT-1R光谱的特殊指纹区为基础，光谱反映的是整个细胞所有组成成分的化学键的振动情况，因此可以区分生化信息上的差别。FT-1R提供整个微生物菌体生化组成成分的光谱定量信息，反应微生物的信息相比更全面。其优点在于分辨率高、鉴定时间短、成本低。但光谱技术在微生物分类鉴定中的应用尚不够系统和成熟，尚不够规范，有待对其进行统一并形成标准方法。目前国内外还没有对上述12种真菌的规范、统一的FT-1R分类 鉴定方法公开，也没有关于13种真菌FT-1T光谱信息共享数据库的公开，该专利技术可弥补上述缺陷，建立12种真菌的规范、统一的FT-1R分类鉴定方法。
技术实现思路
本专利技术属于对12种真菌的分类鉴定，具体地说是应用FT-1R技术，结合化学计量学运算，实现对 F.graminearum、A.terricola、P.citreonigrum、A.f lavus>A.parasiticus、P.aurantiogriseum、T.pseudokoningi1、A.humicola、P.viridicatum、A.funigatus、A.uersicolor>F.solani的分类鉴定。包括建立12种标准菌株光谱信息数据库,规范并统一细菌培养条件、样品制备条件、光谱采集参数及数据分析方法等。本专利技术所采用的技术方案为:应用FT-1R技术，建立F.graminearum、A.terricola、P.citreonigrum、A.flavus、A.parasiticus、P.aurantiogriseum、T.pseudokoningi1、A.humicola、P.viridicatum、A.funigatus>A.uersicolor、F.solani 等12种标准菌株的光谱信息数据库，同时规范并统一细菌培养条件、样品制备条件、光谱采集参数及数据分析方法。采用相同细菌培养、样品制备及光谱采集方法，获得可疑待测菌的光谱数据，与12种标准菌株的光谱信息数据库合并，并进行分级聚类分析(hierarchicalcluster analysis, HCA)，相同菌的图谱应归为一类，根据获得可疑待测菌的归类图谱情况，实现对待测菌的分类鉴定。本专利技术涉及的12种真菌的FT-1R分类鉴定方法，依次包括下列步骤(1)-(2):(I)建立12种真菌的红外光谱信息数据库①细菌的培养:用无菌接种环挑取标准菌株F.graminearum CGMCC3.4733、A.terricola CGMCC3.3557、P.citreonigrum CGMCC3.5694、A.flavus CGMCC3.6434、A.parasiticus CGMCC3.6156、P.aurantiogriseum CGMCC3.5691、T.pseudokoningiiCGMCC3.3002、A.humicola CGMCC3.3907、P.viridicatum CGMCC3.5690、A.funigatusCGMCC3.6452、A.uersicolor CGMCC3.6410、F.solaniCPCC460008 一环，接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)平板上，28°C ±1°C静置培养5d;②硒化锌(ZnSe)窗片的制作:在无菌操作工作台中，用灭好菌的小铁勺将培养好的菌丝刮下,放入盛有ImL无菌生理盐水的1.5mL离心管中，5000g离心5min,吸弃上清,力口入ImL无菌生理盐水悬浮洗漆,5000g离心5min,再加入ImL超纯水悬浮洗漆,5000g离心5min，超纯水重复洗涤两次。最后用50 μ L超纯水悬浮混匀。用微量移液器分别吸取各不同稀释度的菌悬液10 μ L于ZnSe窗片中心位置，水平置于45°C干燥箱中烘干至无水分的干燥菌斑；③读取真菌4000 600CHT1波数范围的红外光谱:光谱参数为:模式为透过率模式(采用气氛补偿功能去除环境大气中的水蒸气和CO2的吸收光谱干扰)。实验参数为 波段范围4000 e OOcnT1，光谱分辨率4CHT1，64次光谱累计求平均。每种菌至少做6次试验，每次做3个重复并取平均，获得6个有效光谱数据；④光谱预处理:对12种真菌4000 600CHT1波数范围的红外光谱依次进行如下处理:透过率-吸光度转化、基线校正、矢量归一化、光谱-excel数据转换，即建立了 12种真菌的红外光谱信息数据库；⑤聚类方法的建立:对12种真菌的900-18000^1和2800-3700^^1波数范围光谱数据进行分级聚类分析(HCA)，获得实现12种真菌分类鉴定的方法参数:HCA:皮尔森积矩相关系数(Ward’ s method, Pearsonr)。(2)对目标菌的分类鉴定采用上述真菌培养、硒化锌(ZnSe)窗片制作、光谱采集及光谱预处理方法，获得可疑待测目标菌的红外光谱数据。将其与12种标准菌株的光谱信息数据库合并，按照上述方法对合并后的数据重新进行分级聚类分析(HCA)，相同菌的图谱应归为一类，根据待测菌在数据库中的归类图谱情况，实现对待测菌的分类鉴定。F.graminear本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种对禾谷镰孢霉、栖土曲霉、黄暗青霉、黄曲霉、寄生曲霉、桔灰青霉、拟康氏木霉、土生链孢霉、鲜绿青霉、烟曲霉、杂色曲霉、茄病镰刀菌等12种真菌的的分类鉴定方法，其特征在于数据库的建立：对禾谷镰孢霉(Fusarium?graminearum，F.graminearum)CGMCC3.4733、栖土曲霉(Aspergillus?terricola，A.terricola)CGMCC3.3557、黄暗青霉(Penicillium?citreonigrum，P.citreonigrum)CGMCC3.5694、黄曲霉(Aspergillus?flavus，A.flavus)CGMCC3.6434、寄生曲霉(Aspergillus?parasiticus，A.parasiticus)CGMCC3.6156、桔灰青霉(Penicillium?aurantiogriseum，P.aurantiogriseum)CGMCC3.5691、拟康氏木霉(Trichoderma?pseudokoningii，T.pseudokoningii)CGMCC3.3002、士生链孢霉(Alternaria?humicola，A.humicola)CGMCC3.3907、鲜绿青霉(Penicillium?viridicatum，P.viridicatum)CGMCC3.5690、烟曲霉(Aspergillus?funigatus，A.funigatus)CGMCC3.6452、杂色曲霉(Aspergillus?versicolor，A.uersicolor)CGMCC3.6410、茄病镰刀菌(Fusarium?solani，F.solani)CPCC460008等12种标准菌株4000～600cm?1波数范围的傅立叶变换红外光谱(Fourier?transform?infrared?spectroscopy，FTIR)依次进行如下处理：透过率?吸光度转化、基线校正、矢量归一化、光谱?excel数据转换，即建立了12种真菌的红外光谱信息数据库。...
【技术特征摘要】
1.一种对禾谷键抱霉、栖土曲霉、黄暗青霉、黄曲霉、寄生曲霉、結灰青霉、拟康氏木霉、土生链孢霉、鲜绿青霉、烟曲霉、杂色曲霉、茄病镰刀菌等12种真菌的的分类鉴定方法，其特征在于数据库的建立: 对禾谷键抱霉(Fusarium graminearum, F.graminearum) CGMCC3.4733、栖土曲霉(Aspergillus terricola, A.terricola)CGMCC3.3557、黄暗青霉(Penicilliumcitreonigrum, P.citreonigrum) CGMCC3.5694、黄曲霉(Aspergillus f lavus, A.flavus)CGMCC3.6434、寄生曲霉(Aspergillus parasiticus, A.parasiticus)CGMCC3.6156、桔灰青霉(Penicillium aurantiogriseum, P.aurantiogriseum)CGMCC3.5691> 拟康氏木霉(Trichoderma pseudokoningii, T.pseudokoningii)CGMCC3.3002、士生链抱霉(Alternaria humicola,A.humicola)CGMCC3.3907、鲜绿青霉(Penicillium viridicatum,P.viridicatum)CGMCC3.5690> 烟曲霉(Aspergillus funigatus, A.funigatus)CGMCC3.6452、杂色曲霉(Aspergillus versicolor,A.uersicolor)CGMCC3.6410、爺病键刀菌(Fusarium solani,F.solani) CPCC460008 等 12 种标准菌株 4000 ΘΟΟαιΓ1 波数范围的傅立叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy, FT IR)依次进行如下处理:透过率-吸光度转化、基线校正、矢量归一化、光谱-excel数据转换，即建立了 12种真菌的红外光谱信息数据库。2.根据权利要求1所述的12种真菌的傅立叶变换红外光谱鉴别方法，其特征是依次包括以下步骤: (1)细菌的培养:用无菌接种环挑取可疑 F.graminearum、Aterricola、P.citreonigrum、A.flavus、A.parasiticus、P.auranti...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨丽君，李兆杰，王静，徐成钢，
申请(专利权)人：威海出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：
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